棉鈴蟲細胞色素P450基因CYP9A17v2啟動子活性分析.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Hubner）是一種世界性的重要經濟害蟲，其發(fā)生和危害嚴重影響到棉花的產量和質量。由于長期采用化學防治，棉鈴蟲對多種化學藥劑尤其是擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生了嚴重的抗性.細胞色素P450基因的過量表達導致解毒代謝增強是棉鈴蟲對擬除蟲菊酯產生抗性的主要機理。屬于CYP9和CYP6家族的多個P450基因的過量表達已被證實與棉鈴蟲對殺蟲劑的解毒代謝有關。本文對棉鈴蟲P450基因CYP9A12，CYP

2、gA17v2的5’-調控區(qū)進行了擴增，并采用報告基因技術對CYP9A17v2核心啟動子區(qū)進行了缺失分析，以期找出其過量表達的調控機理，同時對CYP9家族基因（CYP9A12，CYP9A14，CYP9A17v2）和CYP6家族基因（CYP687）的編碼區(qū)cDNA多態(tài)性進行了分析。
　　 1.棉鈴蟲細胞色素P450基因CYP9A12和CYP9A17v25’-調控區(qū)克隆和序列分析
　　 細胞色素P450基因CYP9A12和CY

3、P9A17v2的過量表達和棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關。以YG和YGF品系基因組DNA為模板，經PCR擴增和測序，獲得CYP9A125’-調控區(qū)序列約2.6kb，CYP9A17v25’-調控區(qū)序列約3.4klb。通過BDGP在線分析軟件預測出各基因的轉錄起始位點，并利用日本京都大學KEGG序列數據庫MOTIF檢索分析服務系統(tǒng)預測出上游啟動子區(qū)域內兩個基因的轉錄因子結合位點。通過對棉鈴蟲抗性和對照品系中這兩個基因5’-調控區(qū)的克隆和

4、序列分析，為下一步研究棉鈴蟲P450基因表達調控機制奠定了重要基礎。
　　 2.棉鈴蟲細胞色素P450基因CYPgA17v2核心啟動子區(qū)缺失分析
　　 CYP9A17v2的過量表達與棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性相關。為了研究CYP9A17v2表達調控機制，對CYP9A17v2核心啟動子區(qū)域的功能進行了分析。構建了含熒光素酶報告基因（1uc）和CYP9A17v2啟動子不同長度缺失片段（-1095～+43）的重組質粒，轉

5、染sf9細胞瞬時表達后用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性。功能分析的結果表明：所有構建的7個缺失片段均具有啟動子活性，-197～+43啟動子區(qū)域的轉錄活性最高。在CYP9A17v2基因5’-調控區(qū)-197～.113區(qū)域內可能存在轉錄增強因子的結合位點，而在-1095～-197區(qū)域內可能存在轉錄抑制因子的結合位點。本研究為探索棉鈴蟲CYP9A17v2過量表達的轉錄調控機理奠定了重要基礎。
　　 3.棉鈴蟲擬除蟲菊酯抗性相關

6、細胞色素P450基因多態(tài)性分析
　　 CYP9家族基因（CYP9A12、CYP9A14、CYP9A17v2）和CYP6家族基因（CYP687）均與棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關.本研究對棉鈴蟲擬除蟲菊酯抗性品系YGF、抗性對照品系YG、敏感品系SCD、田問品系GY中這四個基因的全長cDNA序列進行了克隆和比較。其開放閱讀框均存在單核苷酸多態(tài)性位點，導致多個位點的氨基酸替換，在P450較為保守的血紅素結合區(qū)和螺旋K保守區(qū)等區(qū)域