棉鈴蟲細胞色素P450 CYP9A亞家族的表達調控機理及進化關系研究.pdf

1、棉鈴蟲是一種世界性重要害蟲,棉鈴蟲對擬除蟲菊酯的抗性是與棉花安全生產密切相關的重要問題。國內外大量研究表明,細胞色素P450基因過量表達導致的解毒作用增強是棉鈴蟲對擬除蟲菊酯產生抗性的重要機理。本文對與棉鈴蟲對擬除蟲菊酯抗性相關的3個P450基因CYP9A12,CYP9A14和CYP9A17的基因結構和5’-端基因表達調控區(qū)進行克隆、測序和進化關系分析,為棉鈴蟲P450基因表達調控機制的研究奠定了一定基礎。 1.棉鈴蟲細胞色素P

2、450 CYP9A亞家族基因組的克隆和序列分析根據已獲得棉鈴蟲CYP9A亞家族中CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2的cDNA序列設計引物,在標準敏感品系SCD、擬除蟲菊酯抗性品系YGF以及抗性對照品系YG中進行PCR擴增,分別獲得這3個基因的全長基因組序列,利用GeneDoc軟件對所獲得的基因組序列進行比較分析。結果顯示,基因CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2均存在9個內含子,且插入位點極其相近。已有的研

3、究表明基因CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2位于同一進化分枝。推測這3個基因源于同一始祖基因,進化的機制可能是通過基因的重復拷貝以及隨后的歧異。 2.棉鈴蟲細胞色素P450基因非翻譯區(qū)的克隆和序列分析細胞色素P450 CYP9A亞家族部分基因的過量表達已被證實與棉鈴蟲對擬除蟲菊酯的抗性相關。為探明棉鈴蟲細胞色素P450 CYP9A亞家族基因(CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2)的表達調控機理,根據

4、本實驗室已獲得的棉鈴蟲CYP9A亞家族基因全長基因組的5’-末端核苷酸序列,設計幾組反向特異性引物,進行基因組步移,分別獲得棉鈴蟲敏感品系SCD以上3個P450基因的5’-非翻譯序列,再根據所獲得的序列設計引物,經PCR擴增,分別獲得棉鈴蟲擬除蟲菊酯抗性品系YGF以及抗性對照品系YG的5’-非翻譯區(qū)序列。通過NNPP在線分析軟件分別預測出各基因的轉錄起始位點,并利用TFSEARCH 1.3在線分析軟件預測出上游啟動子區(qū)域內各轉錄因子結合

5、位點。通過敏感與抗性品系5’-非翻譯區(qū)序列的比較,分析其差異位點,為下一步深入研究棉鈴蟲中細胞色素P450的表達調控機制及其參與殺蟲劑抗性的分子機理奠定基礎。 3.昆蟲細胞色素P450 CYP9A亞家族的基因進化根據GenBank以及相關的P450網站已提交的CYP9家族的序列,通過序列比對以及系統(tǒng)進化樹的構建,初步確定CYP9家族源自同一個始祖基因,經基因重復以及隨后的歧異進而形成功能的分化,而內含子的丟失亦是造成分化的重要原因之一。