棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞色素P450 CYP9A33與羧酸酯酶CXE6基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera為世界性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，危害多種經(jīng)濟(jì)作物。由于化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，其對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性。作為典型的鱗翅目夜蛾科昆蟲(chóng)，其嗅覺(jué)靈敏，成蟲(chóng)通過(guò)觸角檢測(cè)環(huán)境中的氣味物質(zhì)，以尋找寄主、配偶與產(chǎn)卵場(chǎng)所。氣味物質(zhì)通過(guò)其觸角表皮進(jìn)入感器腔道淋巴液，由氣味結(jié)合蛋白運(yùn)至嗅覺(jué)受體，隨后在感器腔內(nèi)或感器基部細(xì)胞中被相關(guān)酶降解，以使昆蟲(chóng)免遭環(huán)境氣味物質(zhì)的持續(xù)刺激。因此其闡明嗅覺(jué)信號(hào)失活機(jī)理，有利于尋找新的防治靶標(biāo)位點(diǎn)。

2、
　　本研究以棉鈴蟲(chóng)頭部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用基因拼接、BLAST、RT-PCR、RACE等手段從棉鈴蟲(chóng)觸角中克隆得到一條P450基因、一條羧酸酯酶基因，并采用熒光定量PCR技術(shù)研究了二者的時(shí)空表達(dá)情況，對(duì)P450基因進(jìn)行了原核表達(dá)與Western blot檢測(cè)，主要結(jié)果如下:
　　(1)所得棉鈴蟲(chóng)P450基因cDNA序列全長(zhǎng)1772 bp，命名為CYP9A33（GenBank登錄號(hào)為JX486677），其開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)15

3、90 bp，編碼529個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)分別為61.62kD和7.97。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，CYP9A33與其他昆蟲(chóng)CYP9A亞家族序列一致性達(dá)60％以上，其中與甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae CYP9A13一致性最高，達(dá)75％。二者二級(jí)結(jié)構(gòu)高度一致，6個(gè)底物識(shí)別位點(diǎn)(substrate recognition sites，SRSs)序列一致性達(dá)61％，底物與酶結(jié)合通道開(kāi)關(guān)Ⅰ螺旋中SRS4序列完全相

4、同;CYP9A33編碼蛋白中第25-529位氨基酸位于膜表面，2-24位氨基酸之間形成一個(gè)典型的跨膜螺旋。
　　(2) CYP9A33在成蟲(chóng)各組織中均有表達(dá)，以腹部和頭中表達(dá)量最高，且雌、雄蛾各組織間表達(dá)量均差異顯著。在棉鈴蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育階段也均表達(dá)，以雄蛹中的表達(dá)量最高，其次為雌蛹;在卵及各齡期幼蟲(chóng)中表達(dá)量均較低，且差異不顯著;除剛羽化雄蛾和羽化后24 h雌、雄蛾觸角外，CYP9A33在其它日齡成蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量均顯著高于幼蟲(chóng)與卵。

5、
　　(3)成功構(gòu)建了CYP9A33基因部分片段融合表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)以及SDS-PAGE和Western blot分析，結(jié)果表明融合蛋白得到了正確表達(dá)。
　　(4)所得羧酸酯酶基因cDNA序列全長(zhǎng)2002 bp，命名為HaCXE6(Genbank登錄號(hào)為JX306730)。其開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1623 bp，編碼540個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白分子量為61.02kD，等電點(diǎn)為8.06;該

6、基因預(yù)測(cè)氨基酸序列與?；页嵋苟闟podoptera littoralis觸角羧酸酯酶CXE6的一致性最高，為68％;含有絲氨酸活性中心FGGDPSKVTTAGESYG和催化三聚體(Ser199，Glu323，His434)等羧酸酯酶保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)化分析表明，昆蟲(chóng)親緣關(guān)系越近，羧酸酯酶氨基酸序列一致性越高，同屬夜蛾科的棉鈴蟲(chóng)、?；页嵋苟?、西非蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioodes聚在一起。棉鈴蟲(chóng)不同功能COEs序列關(guān)聯(lián)

7、性分析顯示，HaCXE6與棉鈴蟲(chóng)其他功能羧酸酯酶一致性很低，卻獨(dú)與氣味降解酶CCE006a最先聚在一起，預(yù)測(cè)HaCXE6可能參與嗅覺(jué)相關(guān)功能。
　　(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示HaCXE6在棉鈴蟲(chóng)成蟲(chóng)各組織中均有表達(dá)，以雌蛾腹部與雄蛾足中表達(dá)量最高，且雌、雄蛾各組織間表達(dá)量均差異顯著，腹部、足、觸角等組織差異極顯著水平。HaCXE6在棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育階段均有表達(dá)，其中以雄蛹期表達(dá)量最高，其次為雌蛹期;成蟲(chóng)期僅觸角中表達(dá)量就顯著高于各