魚類淋巴囊腫病毒32kDa黏附蛋白的特性分析.pdf

1、淋巴囊腫病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)是魚類淋巴囊腫病的病原,呈世界性分布,可感染42科140種以上的淡水、半咸水和海水魚類。該病自1997年在我國山東威海地區(qū)的養(yǎng)殖牙鲆中首次暴發(fā)以來,迅速蔓延至遼寧、河北、浙江等沿海省份,給我國的魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。LCDV是具有囊膜的大分子DNA病毒,囊膜病毒通過囊膜上的單個或多個黏附蛋白與宿主靶細(xì)胞上的受體蛋白發(fā)生特異性結(jié)合而吸附到靶細(xì)胞表面,介導(dǎo)病

2、毒與細(xì)胞上的蛋白發(fā)生構(gòu)型變化,促進(jìn)宿主細(xì)胞膜與病毒囊膜融合,使病毒的遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行復(fù)制。研究病毒囊膜上的黏附蛋白對于闡明病毒感染和致病的分子機(jī)制具有重要意義。
　　實驗室前期曾在牙鲆(Paralichthys olivaceus)鰓細(xì)胞(FG)上鑒定出一個分子量為27.8kDa的LCDV細(xì)胞受體蛋白,并制備了2株抗27.8kDa受體蛋白的單克隆抗體(2G11、3D9),2株抗體都能有效阻斷LCDV對FG細(xì)胞的感染。應(yīng)用抗

3、27.8kDa受體蛋白單克隆抗體與Far-western技術(shù)在LCDV上發(fā)現(xiàn)一個分子量為32kDa的蛋白能夠與27.8kDa受體蛋白特異性結(jié)合,質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明該32kDa蛋白是LCDV上038開放閱讀框(Open reading frame038,ORF038)編碼的蛋白。本論文通過構(gòu)建LCDV ORF038基因的原核表達(dá)載體,重組表達(dá)得到ORF038蛋白,制備了其多克隆抗體,并對該32kDa病毒蛋白進(jìn)行了特性分析,證明該蛋白是LCD

4、V的黏附蛋白,在病毒入侵FG細(xì)胞中發(fā)揮重要作用,為研究LCDV感染宿主的分子機(jī)理,以及尋找阻斷病毒感染的有效途徑提供了基礎(chǔ)資料。具體研究結(jié)果如下:
　　根據(jù)LCDV ORF038基因序列,設(shè)計特異性引物,將ORF038基因和pET-32a表達(dá)載體進(jìn)行定向克隆,構(gòu)建了LCDV ORF038融合表達(dá)載體pET32a-ORF038,轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli表達(dá)菌BL21(DE3),親和層析柱(GE)純化重組表達(dá)蛋白,

5、獲得分子量大小為50kDa的重組表達(dá)蛋白;利用該重組蛋白免疫新西蘭白兔,制備了兔抗ORF038重組表達(dá)蛋白多克隆抗體(多抗);對LCDV總蛋白和ORF038重組表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blotting分析,結(jié)果顯示在分子量約32kDa和50kDa處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶,而陰性對照無條帶出現(xiàn),表明該抗體具有良好的特異性。
　　利用制備的兔抗ORF038重組蛋白血清與LCDV孵育,膠體金標(biāo)記羊抗兔IgG作為二抗

6、,免疫電鏡技術(shù)定位ORF038蛋白編碼的32kDa病毒蛋白在LCDV上的分布,結(jié)果顯示,膠體金顆粒位于LCDV粒子的囊膜上,表明ORF038基因編碼的32kDa蛋白是LCDV的囊膜蛋白。利用FITC標(biāo)記的LCDV ORF038重組表達(dá)蛋白與FG細(xì)胞孵育,免疫熒光實驗結(jié)果顯示,在FG細(xì)胞表面出現(xiàn)綠色陽性信號,表明該重組蛋白能夠與 FG細(xì)胞膜上的受體蛋白結(jié)合。
　　阻斷ELISA實驗發(fā)現(xiàn)ORF038重組表達(dá)蛋白可以阻斷單克隆抗體(2G

7、11、3D9)與27.8kDa受體蛋白間的結(jié)合,阻斷率為63.2％;體外感染中和實驗中,將ORF038重組表達(dá)蛋白兔多抗進(jìn)行梯度稀釋,并與LCDV預(yù)孵育,然后感染FG細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著抗體濃度的增加,FG細(xì)胞出現(xiàn)CPE的時間相應(yīng)延遲,且發(fā)生病變的細(xì)胞數(shù)量明顯降低,抑制效果與多抗?jié)舛却嬖趧┝恳蕾囆?yīng),表明該兔多抗可以有效中和LCDV,進(jìn)一步證明LCDV的32kDa蛋白是病毒黏附蛋白,能夠與FG細(xì)胞上27.8kDa受體蛋白相互作用,在LC