磷高效利用功能互補(bǔ)型轉(zhuǎn)基因大豆的構(gòu)建與分子檢測.pdf

1、磷是植物生長發(fā)育所需的重要營養(yǎng)元素之一，它是生物體內(nèi)ATP、核酸、磷脂等關(guān)鍵分子的主要成分，并且在能量轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)激活以及新陳代謝調(diào)節(jié)等方面都起著非常重要的作用。但是，在農(nóng)業(yè)土壤中有50％-70％的磷是不能被植物直接吸收利用的有機(jī)磷，而能被植物直接利用的速效無機(jī)磷很少，由此低磷環(huán)境就成為植物正常生長的限制因素之一。植酸酶是一類能夠水解有機(jī)磷(特別是植酸形式)使其釋放出其中無機(jī)磷的酶類。目前很多研究運(yùn)用分子遺傳操作技術(shù)將植酸酶基因轉(zhuǎn)入植物

2、，增強(qiáng)植物表達(dá)植酸酶的能力，從而提高植物對土壤中有機(jī)磷的分解利用。
　　 植物在低磷環(huán)境下進(jìn)化形成很多低磷應(yīng)答機(jī)制，該應(yīng)答系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)錄因子、磷轉(zhuǎn)運(yùn)體、microRNA等生物分子以及類泛素化、磷酸化等蛋白活性調(diào)節(jié)機(jī)制。其中，PHR1轉(zhuǎn)錄因子通過兩條途徑調(diào)節(jié)磷饑餓應(yīng)答，在低磷脅迫應(yīng)答機(jī)制中起著中心調(diào)節(jié)作用。
　　 大豆是我國重要的油料作物，發(fā)展大豆種植業(yè)、培育大豆新品種對于發(fā)展我國畜牧業(yè)、食品業(yè)以及增強(qiáng)大豆產(chǎn)量都具有非常重要

3、的意義。
　　 本研究運(yùn)用同源重組技術(shù)首次從羽扇豆中克隆得到其調(diào)節(jié)低磷應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因PHR1，并擴(kuò)增得到了無花果曲霉中植酸酶編碼基因phyA的根特異性表達(dá)單元KSA，將二者分別克隆到marker-free表達(dá)載體pX6中，得到了無選擇標(biāo)記的植物表達(dá)載體pX6-PHR1和pX6-KSA。此外，將PHR1基因的低磷脅迫調(diào)節(jié)功能與phyA表達(dá)單元的植酸酶分泌表達(dá)功能集于一身，構(gòu)建得到了磷利用功能互補(bǔ)型植物表達(dá)載體pX6-PHR

4、1-KSA。
　　 應(yīng)用液氮凍融法將植物表達(dá)載體pX6-PHR1、pX6-KSA和pX6-PHR1-KSA分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，得到含有上述表達(dá)載體的植物轉(zhuǎn)化工程菌。運(yùn)用floral dip法將pX6-PHR1和pX6-PHR1-KSA農(nóng)桿菌工程菌轉(zhuǎn)化大豆中黃13，共操作185株大豆植株，得到3424個(gè)豆莢，7712粒種子。用PCR及Sourthern斑點(diǎn)雜交共檢測pX6-PHR1轉(zhuǎn)化大豆種子410粒，pX6-PHR1-K