利用寡核苷酸芯片對Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆檢測及鑒定技術(shù)的研究.pdf

1、面對愈來愈復(fù)雜的正在研究和即將上市的轉(zhuǎn)基因植物,傳統(tǒng)的目前應(yīng)用最廣泛的PCR檢測技術(shù)已不能完全滿足大量、快速和對未知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的要求.基因芯片技術(shù)的出現(xiàn),實現(xiàn)了對樣品的高通量檢測與篩選,檢測效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍.但目前基因芯片技術(shù)(寡核苷酸微陣列)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測的研究不僅僅處于初期階段.該研究選取其遺傳背景信息清楚,商業(yè)化應(yīng)用非常廣泛的轉(zhuǎn)基因模式植物-Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆作為主要研究材料,Bt176和Bt

2、11轉(zhuǎn)基因玉米為輔助研究材料,將寡核苷酸芯片檢測技術(shù)應(yīng)用于Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆檢測及鑒定的研究,對以下幾方面的問題進(jìn)行了研究和探討.一、針對Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆的基因盒結(jié)構(gòu)及其它對照轉(zhuǎn)基因材料就篩選基因,種屬相關(guān)基因,目的基因,交聯(lián)結(jié)構(gòu)基因,特異結(jié)構(gòu)基因等15個基因進(jìn)行了普通PCR擴(kuò)增并測序鑒定.每個基因的擴(kuò)增都以轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因模板DNA對照進(jìn)行.結(jié)果表明,按CTAB法提取的DNA符合PCR擴(kuò)增要求,轉(zhuǎn)

3、基因和非轉(zhuǎn)基因模板DNA對每個目的基因的擴(kuò)增都與預(yù)期結(jié)果一致,說明PCR反應(yīng)體系正常,模板DNA未被污染.對每個目的片段的直接測序結(jié)果與設(shè)計的引物擴(kuò)增片段序列相符.二、制備檢測及鑒定Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆的寡核苷酸芯片;測序結(jié)果包含探針序列或互補(bǔ)序列,所產(chǎn)生的有效信號與預(yù)期結(jié)果一致,與凝膠電泳檢測結(jié)果相符,表明所制備的寡核苷酸芯片特異性好;寡核苷酸芯片檢測靈敏度及特異性要優(yōu)于凝膠電泳法檢測.三、對芯片檢測中常用的兩種熒光標(biāo)

4、記法-隨機(jī)引物熒光標(biāo)記法和PCR反應(yīng)熒光標(biāo)記進(jìn)行了比較研究.從檢測特異性,信號強(qiáng)度,信噪比指標(biāo)進(jìn)行綜合評價,對轉(zhuǎn)基因檢測的寡核苷酸芯片配合PCR反應(yīng)熒光標(biāo)記法為佳.四、針對Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆建立及優(yōu)化了兩套多重PCR反應(yīng)體系(分別為四重及五重PCR反應(yīng)),兩套多重PCR產(chǎn)物混合雜交,可在一張芯片上同時檢測8個相關(guān)基因,從而實現(xiàn)利用該寡核苷酸芯片完成對Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆檢測及鑒定的目的.五、對Bt176

5、和Bt11轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米建立及優(yōu)化了五重PCR反應(yīng)體系;現(xiàn)有寡核苷酸芯片可有效檢測及鑒定Bt176和Bt11轉(zhuǎn)基因玉米,確證該寡核苷酸芯片的特異性能良好.六、針對影響多重PCR產(chǎn)物雜交信號的有關(guān)因素進(jìn)行優(yōu)化,并與通常使用的雜交體系進(jìn)行比較,結(jié)果表明,雜交時間宜為40分鐘,SSC濃度宜采用5×SSC外,雜交溫度,甲酰胺濃度與通常雜交條件無異,強(qiáng)調(diào)熒光標(biāo)記好的PCR產(chǎn)物雜交前要進(jìn)行變性處理.該課題的開發(fā)和研究結(jié)果為寡核苷酸芯片技術(shù)