小麥葉片中與Rubisco大亞基降解相關(guān)的蛋白酶的生化特性、合成定位及分離純化研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，小麥葉片中存在著能夠降解1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亞基(LSU)為51KDa的相關(guān)蛋白酶，而且該蛋白酶在其分離純化過(guò)程中與Rubisco緊密結(jié)合。
　　 本文以小麥3E158(Triticum aestivum L.cv.3E158)和揚(yáng)麥158(Triticum aestivum L.cv.Yangmai158)葉片為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)天然梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳(GPAGE)后切膠回收

2、得到的Rubisco，應(yīng)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-FAGE)分離Rubisco蛋白亞基及蛋白酶，分別采用SDS-PAGE、加明膠的活性SDS-PAGE鑒定蛋白質(zhì)和檢測(cè)蛋白酶的方式，研究了該蛋白酶的生化特性和合成的細(xì)胞定位，并對(duì)與Rubisco緊密結(jié)合的蛋白酶的分離純化進(jìn)行了進(jìn)一步嘗試。其主要研究結(jié)果簡(jiǎn)述如下:
　　 1、與Rubisco大亞基降解相關(guān)的蛋白酶的生化特性
　　 小麥粗酶提取液經(jīng)過(guò)非變性梯度(5％-

3、10％)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過(guò)切膠方法回收含有Rubisco的凝膠，我們得到了純度很高的Rubisco全酶。將這種Rubisco全酶在不同的溫度下進(jìn)行處理2h，發(fā)現(xiàn)降解LSU的蛋白酶的最適溫度為40～50℃。研究不同濃度的ATP對(duì)Rubisco大亞基的降解影響，結(jié)果表明，在添加1mmol·L-1 ATP下能加速LSU降解，并降解成很多小的片段;添加的ATP濃度過(guò)高或過(guò)低，LSU降解程度相對(duì)較弱。
　　 選取小麥初生葉（平均葉

4、長(zhǎng)2cm）為材料，切膠回收得到純度很高的Rubisco全酶。將這種Rubisco全酶在40℃下保溫處理6h后，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)能夠清晰的得到Rubisco大亞基被降解為51KDa的條帶;同時(shí)，對(duì)上述樣品煮沸5min，再進(jìn)行適宜溫度下保溫反應(yīng)6h，發(fā)現(xiàn)此時(shí)LSU不再發(fā)生降解。因此，我們認(rèn)為，降解Rubisco大亞基為51KDa的相關(guān)蛋白酶在小麥葉片的生長(zhǎng)初期即已存在。
　　 2、與Rubisco大亞基降解相關(guān)的蛋白酶

5、合成的細(xì)胞定位
　　 選用兩種蛋白質(zhì)合成抑制劑——放線菌酮（核基因編碼蛋白質(zhì)合成抑制劑）和林可霉素（葉綠體基因編碼蛋白質(zhì)合成抑制劑），分別浸泡處理暗處的小麥葉片。不同濃度（0.01、0.1和1mg/ml）的上述抑制劑作用葉片后，提取葉片粗酶液，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)LSU的降解情況，結(jié)果顯示，林可霉素抑制LSU降解作用更明顯。此外，1mg/ml林可霉素的抑制作用更好。
　　 1mg/ml的兩種抑制劑，單獨(dú)及其混合溶液暗

6、處浸泡處理葉片1d，然后在pH7.5的Tis-HCl緩沖體系和pH5.5的檸檬酸緩沖體系下，通過(guò)聚丙烯酰胺電泳及切膠回收得到相應(yīng)緩沖體系下的Rubisco全酶，SDS-PAGE檢測(cè)Rubisco降解為51KDa的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在兩種pH條件下，林可霉素均能較強(qiáng)地抑制蛋白酶對(duì)Rubisco大亞基的降解。此外，1mg/ml抑制劑暗處浸泡處理葉片不同的時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著處理時(shí)間增加，林可霉素處理的Rubisco大亞基發(fā)生降解的情況越少

7、。由此，我們可以確定，葉片暗誘導(dǎo)衰老過(guò)程中合成產(chǎn)生的特異性降解LSU的該蛋白酶可能主要是由葉綠體基因編碼的。
　　 3、分離純化結(jié)合Rubisco并降解大亞基的蛋白酶
　　 切膠回收得到的Rubisco樣品，過(guò)mono-Q強(qiáng)陰離子交換柱，收集Rubisco峰進(jìn)行脫鹽，濃縮后SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果表明，Rubisco仍會(huì)降解，即Rubisco樣品通過(guò)強(qiáng)陰離子交換柱分離依然沒(méi)有將該蛋白酶和Rubisco分開(kāi)。
　　

8、 切膠回收得到的濃度很高的Rubisco酶液進(jìn)行非完全變性（樣液不進(jìn)行加熱煮沸）的SDS-PAGE，電泳后用TritionX-100脫去SDS。然后，分別切膠回收整塊凝膠中Rubisco大亞基、小亞基所在處及分離膠中除大、小亞基位置之外的成分，最后分別將大亞基之外的其他各成分加入大亞基成分中，SDS凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rubisco全酶經(jīng)過(guò)SDS凝膠電泳后，降解Rubisco大亞基的蛋白酶能夠與Rubisco大、小亞基分開(kāi)，而這種蛋白酶