暗誘導(dǎo)衰老小麥葉片內(nèi)一種耐熱蛋白水解酶的分離純化主其生化特性鑒定.pdf

1、植物體內(nèi)的蛋白水解酶在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、衰老及在外界環(huán)境脅迫下的生理適應(yīng)活動(dòng)過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用，尤其在植物葉片的衰老過(guò)程中，葉片中蛋白水解酶同工酶的合成量及其活性都會(huì)有顯著的提高。本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)一直致力于植物葉片衰老過(guò)程中蛋白水解酶同工酶變化的研究，在以小麥為材料的研究中發(fā)現(xiàn)小麥衰老期間葉片內(nèi)存在多種與衰老相關(guān)的蛋白水解酶同工酶，并在對(duì)這些蛋白水解酶的生化特性進(jìn)一步研究中，還發(fā)現(xiàn)了其中有一種性質(zhì)很特殊的蛋白水解酶同工酶，它在小麥生長(zhǎng)

2、幼苗期和衰老期間都有活性，但在衰老期間其活性會(huì)顯著上升，尤其是該蛋白水解酶具有良好的熱穩(wěn)定性。為了更深入的研究這種蛋白水解酶同工酶，本實(shí)驗(yàn)以暗誘導(dǎo)衰老的小麥葉片為材料，通過(guò)生物化學(xué)的研究方法和手段，對(duì)這種蛋白水解酶進(jìn)行了分離純化和生化特性的研究，其主要的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果敘述如下：
　　 1、暗誘導(dǎo)衰老小麥葉片內(nèi)一種耐熱蛋白水解酶的初步分離純化及其生化特性鑒定
　　 本研究以暗誘導(dǎo)衰老48h的小麥（Triticum aest

3、ivum L.cv.Yangmai158）葉片為材料，采用30％-50％飽和度的硫酸銨沉淀，凝膠層析脫鹽后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠蛋白水解酶同工酶活性電泳，再直接切膠用回收槽電洗脫回收方法，初步分離鑒定出了這種耐熱的蛋白水解酶同工酶。用蛋白水解酶活性電泳法檢測(cè)上述回收槽電洗脫回收的樣品，結(jié)果顯示只有一條明顯的蛋白水解酶同工酶條帶，但普通梯度凝膠電泳的結(jié)果顯示該回收樣品中還存在少許雜蛋白。另外，我們對(duì)該酶的一些基本的生化特性也進(jìn)行了研究，結(jié)果顯

4、示該酶具有良好的熱穩(wěn)定性，分離純化后的酶液在0到60℃溫度下處理1h后進(jìn)行蛋白酶活性電泳，其活性無(wú)明顯變化，在70℃溫浴下處理1h后仍有部分活性。且該酶還表現(xiàn)出相當(dāng)寬的pH穩(wěn)定范圍，電泳后的凝膠在pH3.0或pH10.0和80℃條件下處理2h，該酶還存在一定的活性.研究結(jié)果顯示該酶的最適溫度為50℃，最適pH約為8.0。酸性蛋白酶抑制劑pepstatin、金屬蛋白酶抑制劑EDTA和1’10-Phenanthroline以及半胱氨酸蛋白酶

5、抑制劑E-64都不能抑制這種蛋白水解酶同工酶的活性，但絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF能部分抑制該酶的活性。
　　 2、暗誘導(dǎo)衰老小麥葉片內(nèi)一種耐熱蛋白水解酶的分離純化及其生化特性鑒定
　　 上述的純化方案操作比較簡(jiǎn)單，且相對(duì)于常規(guī)的純化比較經(jīng)濟(jì)，但純化后的酶液內(nèi)還具有少量的雜蛋白。因此，我們?cè)谏厦鎸?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)有關(guān)純化方法和過(guò)程進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。具體的方法和步驟如下：以暗誘導(dǎo)衰老48h的小麥葉片為材料，勻漿后離心取上清

6、液（即粗酶液），粗酶液于33℃，pH5.5的條件下溫浴1h，電泳后的染色結(jié)果顯示：上述溫浴處理后的粗酶液中雜蛋白（尤其是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）的含量明顯減少；處理后的酶液先進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀（飽和度為30％-50％），凝膠層析脫鹽后進(jìn)行DEAE陰離子交換柱層析分離；收集酶活性組分透析后通過(guò)Q-sepharose fast flow柱進(jìn)行層析分離；收集蛋白水解酶活性組分經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠蛋白水解酶活性電泳分離后，再采用直接切膠

7、用回收槽電洗脫回收方法，最后分離純化出了該種耐熱的蛋白水解酶，蛋白水解酶活性電泳和梯度凝膠蛋白質(zhì)電泳結(jié)果顯示都為一條帶。對(duì)純化得到的該酶進(jìn)行生物化學(xué)特性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶的最適溫度為55℃左右，在75℃時(shí)處理1h后仍有37％左右的活性；該酶的最適pH約為8.0；10 mmol·L-1絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF處理大約能抑制該酶活性的60％，而酸性蛋白酶抑制劑pepstatin、金屬蛋白酶抑制劑EDTA和EGTA、半胱氨酸蛋白酶抑制劑E

8、-64處理同樣也顯示都不能抑制這種蛋白水解酶的活性。對(duì)該純酶樣品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析，其結(jié)果顯示該蛋白酶與谷胱甘肽還原酶有較好的同源性關(guān)系。
　　 另外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)在其他植物（油菜，白菜，煙草，土豆，番茄）葉片中都有耐熱蛋白水解酶的存在，且它們的分子量和小麥的相比也很相近。本課題研究和其結(jié)果為今后這種蛋白水解酶的抗體制備奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，更為能夠深入地去研究了解這種耐熱的蛋白水解酶在小麥葉片中的細(xì)胞定位、生理生化功能和在其它植