玉米葉片中ABA誘導(dǎo)的p46MAPK的分離純化、質(zhì)譜鑒定及相關(guān)特性的研究.pdf

1、脫落酸(abscisic acid， ABA)是一種重要的植物激素，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)中起著重要的信號(hào)分子作用。促分裂原活化蛋白激酶( Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)是真核細(xì)胞中普遍存在的信號(hào)組分，由逆境脅迫、細(xì)胞因子、植物激素、生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)，并在植物信號(hào)中發(fā)揮重要的作用。已知許多蛋白激酶參與了ABA信號(hào)途徑，MAPK也能夠作為ABA信號(hào)的下游組分，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此，鑒定A

2、BA信號(hào)途徑中相關(guān)的MAPK，對(duì)于揭示ABA信號(hào)的細(xì)胞和分子機(jī)理具有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在研究ABA和H2O2活化玉米(Zea mays)葉片的MAPK時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種分子量為46 kDa的MAPK( p46MAPK)參與ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)，但是我們不知道它是一個(gè)什么類型的MAPK，與其它植物MAPK的同源性怎么樣。澄清它的性質(zhì)對(duì)于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究至關(guān)重要。因此，我們首先對(duì)p46MAPK進(jìn)行分離純化，其次進(jìn)行質(zhì)

3、譜分析并確定類型，最后進(jìn)行相關(guān)特性研究。結(jié)果如下：
　　 1.p46MAPK純化：髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein， MBP)是MAPK的最適底物.我們以MBP為底物，采用溶液激酶分析和凝膠激酶分析（in-gel kinase assay）相結(jié)合的方法對(duì)純化過(guò)程中的目的蛋白進(jìn)行跟蹤鑒定，并在4℃條件下完成所有純化步驟。葉片提取上清液先經(jīng)30％飽和度硫酸銨沉淀，100，000g超速離心，上清經(jīng)80 mlHiP

4、rep26/10（Sephdex G-25F）脫鹽柱脫鹽后，依次進(jìn)行40 ml Q sepharose FF陰離子柱、15 ml Pheny sepharose FF疏水柱、6 ml Resource Q陰離子柱、1 ml Mono Q陰離子柱、3.5 ml poly-L-lysine-agarose親和柱和120 ml Hiload16/60Superdex75pg凝膠過(guò)濾柱和超濾管濃縮。經(jīng)過(guò)上述步驟，最終經(jīng)SDS-PAGE電泳，銀染

5、檢測(cè)45 kDa maker處有單一條帶，凝膠激酶實(shí)驗(yàn)顯示能夠磷酸化MBP底物。對(duì)照與ABA處理的樣品同時(shí)經(jīng)Mono Q純化，進(jìn)一步證明部分純化的蛋白為ABA誘導(dǎo)的p46MAPK。部分純化蛋白的純化倍數(shù)大于10000，回收率為1.1％，激酶活性為20，420 pmol min-1 mg-1。
　　 2.p46MAPK鑒定：質(zhì)譜已成為鑒定蛋白質(zhì)的最重要技術(shù)平臺(tái)之一。將目的蛋白膠切下，送北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心進(jìn)行基質(zhì)

6、輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time- of- flight mass spectrometry，MALDI-TOF-TOF-MS)鑒定。利用BioTools3.0分析軟件在http://www.matrixscience.com的NCBI綠色植物數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，p46MAPK與玉米中已知序列的ZmMP

7、K5(gi|4239889)序列覆蓋達(dá)32％，匹配得分207，匹配顯著（得分大于69為顯著，P＜0.05）。選取肽段(m/z1779.841)進(jìn)行MS/MS鑒定，序列為TTSETDFMTEYVVTR，對(duì)應(yīng)于ZmMPK5的218-232處肽段。為進(jìn)一步證明該結(jié)果，ZmMPK5的多克隆抗體被制備。免疫共沉淀凝膠激酶的結(jié)果顯示ZmMPK5為ABA誘導(dǎo)的p46MAPK。因此，p46MAPK即為ZmMPK5。
　　 3.ZmMPK5生物信

8、息學(xué)分析：利用生物信息學(xué)分析ZmMPK5的分子量、等電點(diǎn)、細(xì)胞定位等。利用NCBI中BLAST軟件，與植物中其他MAPK進(jìn)行了比對(duì)，并構(gòu)建了基因進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZmMPK5分子量為44.9，等電點(diǎn)為5.39，在線軟件程序SubLoc v1.0（http:∥www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）將其定位在細(xì)胞核中，屬于MAPK家族的A族，與小麥TaMAPK、水稻OsSIPK和OsMPK6親緣關(guān)系最近，與

9、苜蓿MMK1、擬南AtMPK6、歐芹PcMPK6、番茄LeMPK2、馬鈴薯StMPKl和煙草SIPK親緣關(guān)系其次，而與玉米中已知的其他MAPK蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。
　　 4.ZmMPK5相關(guān)特性分析：ZmMPK5的凝膠層析分子量為45.74 kDa。在溫度(20-50℃)、MgCl2濃度（2.5-15 mM）和pH(5.0-9.0)情況下，該激酶都具有活性。理想反應(yīng)條件為30℃、pH8.0和10 mM MgCl2。MBP和AT

10、P的Km值分別為0.13μgμL-1和23μM。與histone和caseln相比， MBP是ZmMPK5的首選底物。將磷酸化的MBP水解進(jìn)行薄層層析，其磷酸化位點(diǎn)發(fā)生在蘇氨酸上，而絲氨酸和酪氨酸未見磷酸化，在ZmMPK5:YFP表達(dá)的玉米葉片原生質(zhì)體中，ZmMPK5存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，主要定位在細(xì)胞核中.不同的環(huán)境脅迫因子如低溫、干旱、NaCl、CdCl2、傷害、UV和激素(SA、ETH)均能夠誘導(dǎo)ZmMPK5轉(zhuǎn)錄和ZmMPK5激