酵母雙雜交RRS系統(tǒng)中嬰幼兒小腸組織全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及篩選.pdf

1、背景: 輪狀病毒(rotavirus，RV)是導(dǎo)致全世界嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉病的常見(jiàn)病原之一，每年可導(dǎo)致大約50萬(wàn)患兒死亡。無(wú)論發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，RV的感染率和發(fā)病率都很高。因此迫切需要開(kāi)發(fā)有效的疫苗和治療策略來(lái)對(duì)抗病毒。而這些研究的基礎(chǔ)又需要從根本上認(rèn)識(shí)病毒作用于宿主細(xì)胞的分子機(jī)制。 RV感染細(xì)胞的第一個(gè)關(guān)鍵步驟是病毒與被感染細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合。由于RV受體在宿主細(xì)胞上數(shù)量較少、性質(zhì)復(fù)雜以及技術(shù)方法的局限性，其性質(zhì)迄今不清

2、。全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和功能注釋是了解生物體結(jié)構(gòu)和功能的一種重要方法之一，它有助于鑒定其基因組序列中的外顯子-內(nèi)含子的邊界，分析基因編碼區(qū)和理解基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的功能，是分析人類基因表達(dá)圖譜、功能和結(jié)構(gòu)的重要資源。文庫(kù)篩選作為一種獲取未知功能基因的手段，對(duì)于研究病毒作用于人體的分子機(jī)制起著非常重要的作用。 酵母雙雜交技術(shù)自創(chuàng)立以來(lái)已成為研究蛋白質(zhì)之間相互作用的重要方法之一。傳統(tǒng)的酵母雙雜交方法所研究的蛋白質(zhì)間相互作用是

3、在細(xì)胞核內(nèi)完成的，而近年來(lái)在此基礎(chǔ)之上發(fā)展起來(lái)的酵母雙雜交衍生系統(tǒng)--Ras募集系統(tǒng)(RRS)，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)的相互作用定位于細(xì)胞膜上，更具備了靈敏度高、假陽(yáng)性少等突出優(yōu)點(diǎn)。RRS的應(yīng)用原理為：酵母溫度敏感株由于缺乏鳥(niǎo)苷酸交換因子(GEF)cdc25-2，而不能將外來(lái)信號(hào)傳遞給膜上的Ras蛋白，致使該種突變株在36℃不能存活;如果人為引入正常的GEF(Ras蛋白)，并使得GEF能與膜足夠接近，則可彌補(bǔ)這一缺陷，激活Ras信號(hào)途徑，使酵母細(xì)

4、胞能夠在36℃生長(zhǎng)。 目的：在本研究中，構(gòu)建一個(gè)嬰幼兒小腸組織的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)并將其插入RRS系統(tǒng)中的pUra-M△polyA載體，構(gòu)建成獵物載體，將其與本課題組前期構(gòu)建好的RV外殼蛋白VP4誘餌載體pMet425-Myc-Ras-VP4共轉(zhuǎn)化酵母溫度敏感菌株cdc25-2，通過(guò)RRS篩選文庫(kù)中與RV VP4相互作用的蛋白質(zhì)分子，探尋輪狀病毒與腸道宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制。 方法： 1.從嬰幼兒小腸組織中提取

5、總RNA，并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一、二鏈，連接EcoRI人工接頭，分級(jí)分離后，除去小于500 bp cDNA片段，與pUra-M△polyA連接后，CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，測(cè)定文庫(kù)大小并EcoRI/XhoI雙酶切鑒定插入cDNA片段的大小。 2.將誘餌載體pMet425-Myc-Ras-VP4 與獵物載體pUra-M△polyA-cDNA共轉(zhuǎn)化酵母溫度敏感菌株cdc25-2，通過(guò)改變培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及生長(zhǎng)溫度，

6、去除可能的假陽(yáng)性結(jié)果，篩選出與RV VP4相互作用的蛋白質(zhì)分子。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建含有6×107重組子的嬰幼兒小腸組織全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，插入片段的大小范圍在0.5-2 kb之間，平均長(zhǎng)度1.5kb。 2.通過(guò)Ras募集系統(tǒng)，篩選出陽(yáng)性克隆，序列測(cè)定尚在進(jìn)行中。 結(jié)論： 1.首次構(gòu)建了一個(gè)嬰幼兒小腸組織全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并驗(yàn)證了插入片段大小符合進(jìn)一步篩選所需，庫(kù)容量亦足夠大，是一個(gè)高質(zhì)量的文庫(kù)。