真鯛抗菌肽基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其在酵母中的表達(dá).pdf

1、抗菌肽是具有抗菌活性的短肽的總稱,廣泛存在于生物界.這種內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導(dǎo)而合成.在機(jī)體抵抗病原菌的侵入方面起著重要作用,更被認(rèn)為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分.該研究主要構(gòu)建了真鯛抗菌肽基因Hepcidin和Pleurocidin的酵母表達(dá)載體,并且在甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母巴氏畢赤酵母Pichia pastoris中表達(dá)出重組Hepcidin,通過抑菌活性的檢驗(yàn)和SDS-PAGE驗(yàn)證了所表達(dá)的蛋白質(zhì).通過對(duì)中國(guó)海產(chǎn)名貴經(jīng)濟(jì)魚類真鯛(

2、Pagrus major)抗菌肽基因的擴(kuò)增,分別得到Hepcidin基因100bp左右和Pleurocidin基因100bp左右的成熟肽片段.首先獲得純度較高的含目的基因的載體,隨后對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了分析,得到清晰的目的條帶.大量擴(kuò)增后進(jìn)行初步的濃縮純化,將PCR產(chǎn)物和酵母表達(dá)載體均用xho Ⅰ和xba Ⅰ雙酶切,最后用粘端連接的方法過夜充分連接.經(jīng)過酶切檢驗(yàn)和PCR鑒定,篩選出陽性重組酵母表達(dá)載體,為重組表達(dá)奠定了基礎(chǔ).酵母的轉(zhuǎn)化

3、需要大量的DNA,所以先將重組表達(dá)載體大量制備,用載體單一性的酶sac Ⅰ進(jìn)行消化后,采用電穿孔法進(jìn)行重組載體的轉(zhuǎn)化,設(shè)立濃度剃度涂步平板,以期獲得更多更好的單菌落.酵母的生長(zhǎng)溫度較細(xì)菌低,介入28-30℃之間.將平板于30℃青靜置培養(yǎng)3-7天.挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng).提取酵母基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定.同時(shí)還對(duì)轉(zhuǎn)化子的表型進(jìn)行鑒定,以篩除假陽性.由于存在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)、方式和目的基因拷貝數(shù)等許多不穩(wěn)定因素,將獲得的所有陽性菌株分別進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),