紅掌遺傳轉(zhuǎn)化體系與抗菌肽基因表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、紅掌（Anthurium andraeanum）為天南星科花燭屬多年生草本花卉，因其花葉形態(tài)奇特，花期持久，常作為切花材料；盆栽品種株型優(yōu)美，是廣泛應(yīng)用于室內(nèi)裝飾的花卉。但是，紅掌在栽培生產(chǎn)過(guò)程中，極易受到細(xì)菌性葉斑病的侵害，嚴(yán)重時(shí)造成毀滅性損失，這是國(guó)內(nèi)外紅掌生產(chǎn)上的一大障礙。因此，開展抗病基因工程研究、培育抗病品種具有重要理論意義及應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，就紅掌的再生體系、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系、抗菌肽基因

2、及其修飾、融合基因及植物表達(dá)載體、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化等方面進(jìn)行了研究，取得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　1、優(yōu)化了紅掌的再生體系。以盆栽紅掌品種SYN-A的愈傷組織為供試材料，以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，探討了不同生長(zhǎng)素（2,4-D、NAA、IBA）、不同細(xì)胞分裂素（6-BA、TDZ）及其濃度配比對(duì)紅掌愈傷組織不定芽分化的影響。在本試驗(yàn)條件下，紅掌愈傷組織的不定芽分化率都達(dá)到了76.67％以上，其中最優(yōu)培養(yǎng)基組合為1/2MS+6-BA0.5

3、mg/L+2,4-D0.1 mg/L，愈傷組織的不定芽分化率可達(dá)100%，再分化系數(shù)高達(dá)31.06，且不定芽生長(zhǎng)良好。
　　2、探明了紅掌對(duì)三種抗生素的敏感性差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，紅掌外植體對(duì)潮霉素的敏感性高于卡那霉素，前者更適用于紅掌轉(zhuǎn)基因組織的篩選，其使用濃度以20 mg/L為宜；其次，紅掌外植體對(duì)頭孢霉素的敏感度較低，在添加濃度為600 mg/L、培養(yǎng)8周時(shí)，外植體依然能正常生長(zhǎng)，試驗(yàn)時(shí)使用濃度500 mg/L即可達(dá)到良好的抑

4、菌效果。
　　3、初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅掌遺傳轉(zhuǎn)化體系。以紅掌愈傷組織為受體材料，以農(nóng)桿菌EHA105為供試菌種，通過(guò)正交試驗(yàn)方法，探討了外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、超聲波處理時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響，其影響程度依次為共培養(yǎng)時(shí)間>預(yù)培養(yǎng)時(shí)間>侵染時(shí)間>超聲時(shí)間。初步建立了適用于紅掌的遺傳轉(zhuǎn)化體系：切取1 cm×1 cm×0.5 cm大小的愈傷組織塊、預(yù)培養(yǎng)3 d，以O(shè)D600值為0.6的菌液、侵染時(shí)間20 min

5、，侵染期間超聲波處理20 s，無(wú)需共培養(yǎng)，而后經(jīng)抑菌培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)，可獲得抗性愈傷組織。
　　4、構(gòu)建了含抗菌肽融合基因的植物表達(dá)載體及工程農(nóng)桿菌。應(yīng)用生物信息學(xué)方法，以病程相關(guān)蛋白PR1a的信號(hào)肽與抗菌肽Shiva-1為基本序列，利用紅掌偏愛密碼子進(jìn)行修飾優(yōu)化后，合成了含特異酶切位點(diǎn)的抗菌肽融合基因（命名為AaAMP），并連接入中間載體 pCAMBIA1301，成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-AaAMP，進(jìn)而轉(zhuǎn)化