家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑基因Serpin-6的克隆、序列分析及表達研究.pdf

1、本研究以大造家蠶為材料，取5齡3天的家蠶頭部、中腸、脂肪體、絲腺、精巢、卵巢和血淋巴。以家蠶脂肪體cDNA為模板克隆家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin-6)基因；以頭、中腸、脂肪體、絲腺、精巢、卵巢和血淋巴cDNA為模板做半定量分析。用脂多糖(LPS)刺激5齡3天家蠶后分時間段取其血淋巴和脂肪體，然后以其cDNA為模板做半定量分析。采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)進行家蠶Serpin-6基因的表達研究。主要研究結(jié)果如下： 1.利用BL

2、AST程序，將昆蟲Serpin保守序列與家蠶EST數(shù)據(jù)庫進行比對，拼接后得到一段包含完整ORF的預測的家蠶Serpin序列；根據(jù)此序列設計合適的引物，采用RT-PCR方法以5齡3天大造家蠶脂肪體為材料提取mRNA，克隆了家蠶Serpin-6基因(GenBank登錄號：EU159447)。序列分析表明，家蠶Serpin-6基因編碼區(qū)長度為1242bp，編碼413個氨基酸，相對分子量約為46.47kDa,等電點約為5.48，成熟蛋白質(zhì)的分子

3、量約為44.62kDa。與其他昆蟲的絲氨酸蛋白酶抑制劑同源比較發(fā)現(xiàn)該基因與煙草天蛾Serpin-6基因氨基酸序列的相似性最高，達77.67％，與岡比亞按蚊Serpin-9的次之，相似性為39.51％。而與家蠶Serpin-5的相似性只有22.37％。推測家蠶Serpin-6與煙草天蛾Serpin-6可能屬于直系同源基因，起著相同或類似的作用。將該基因全長cDNA與家蠶基因組比對后發(fā)現(xiàn)該基因包括8個外顯子，7個內(nèi)含子。用SignalP3.

4、0Server程序分析家蠶Serpin-6基因，預測其N-末端第1到第17個氨基酸殘基為信號肽序列。 2.根據(jù)獲得的家蠶Serpin-6基因ORF序列，設計一對引物，進行半定量RT-PCR反應。以5齡3天大造家蠶幼蟲的頭、中腸、脂肪體、絲腺、精巢、卵巢和血淋巴及免疫刺激后不同時間段脂肪體和血淋巴cDNA為模板進行RT-PCR，PCR擴增產(chǎn)物預期大小為349bp，以家蠶actin3基因為內(nèi)參。1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行半定

5、量計算。結(jié)果表明，Serpin-6在家蠶頭部及6個組織中均有表達。在家蠶頭、精巢和卵巢中的表達量最高，在中腸和絲腺中的表達量次之，在脂肪體和血淋巴中的表達量最低。用LPS誘導5齡3天的家蠶，取不同時間段的脂肪體和血淋巴做半定量表達研究，結(jié)果表明，Serpin-6基，因在家蠶脂肪體中經(jīng)誘導后3h表達量上調(diào)，到6h時達到最高，之后逐漸下降。誘導后Serpin-6基因在家蠶血淋巴中的表達情況同誘導脂肪體一樣，誘導3h后該基因表達量呈上調(diào)趨勢，

6、在誘導后6h時，該基因的表達量達到最高，之后從6h到12h，24h逐漸下降，24h時降到該誘導組的最低。由此推測，家蠶Serpin-6基因具有免疫功能，另外，根據(jù)該基因在家蠶頭部及6個組織中的表達差異推測它或許還有其他的功能，這將有待更進一步的研究。 3.將去掉信號肽的家蠶Serpin-6基因克隆進原核表達載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)1mmol/LIPTG誘導蛋白質(zhì)表達。SDS-PAGE電泳分

7、析結(jié)果表明，家蠶Serpin-6基因以融合蛋白形式表達，經(jīng)IPTG誘導轉(zhuǎn)化去信號肽家蠶Serpin-6的BL21菌與對照BL21菌、空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌和非誘導轉(zhuǎn)化去信號肽家蠶Serpin-6的BL21菌相比出現(xiàn)了一條特異性的蛋白質(zhì)條帶，相對分子量約45kDa，推測家蠶Serpin-6在大腸桿菌中得到表達。經(jīng)Westernblot分析表明在預測的約45kDa大小位置出現(xiàn)較明顯的條帶，與推導的融合蛋白分子量相符。而對照BL

8、21菌、空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌和非誘導轉(zhuǎn)化家蠶Serpin-6的BL21菌都沒有檢測到條帶，進一步證明了去信號肽家蠶Serpin-6在大腸桿菌中成功表達。而含有信號肽的家蠶Serpin-6在同樣的實驗條件下，沒有檢測到特異性蛋白條帶。因此推測含有信號肽的家蠶Serpin-6在原核表達體系中不能成功表達可能是受其信號肽序列的影響。 家蠶Serpin-6基因的成功克隆、組織半定量表達、LPS刺激后在不同時間段的半定量表