土豆羧肽酶抑制劑編碼基因的克隆與表達(dá).pdf

1、土豆羧肽酶抑制劑(carboxypeptidaseInhibitorfromPotatoes，CPI)是一種由39個(gè)氨基酸殘基組成的球狀多肽，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其極有可能成為理想的輔助溶栓藥物，以克服目前臨床溶栓藥物使用過程中安全劑量過窄、容易引起出血等缺陷。人血漿羧肽酶B原(carboxypeptidaseB，CPB)也稱凝血酶活化的纖溶抑制劑(thrombin-activatablefibrinolysisinhibitor,TAFI

2、)，經(jīng)激活后形成的TAFIa能抑制纖溶酶原生成纖溶酶，從而抑制纖溶系統(tǒng)的啟動(dòng)，阻礙溶栓。CPI即通過對(duì)TAFIa的特異性抑制，而達(dá)到了治療溶栓的目的。目前獲得土豆羧肽酶抑制劑主要從土豆中提取得到，分離繁瑣，得率較低，來自土豆的有毒物質(zhì)龍葵素難以完全除去。也有報(bào)道通過人工合成cpi基因構(gòu)建分泌表達(dá)質(zhì)粒并在E.coli中成功表達(dá)具有生物活性的重組CPI(reCPI)，但從培養(yǎng)液中分離純化reCPI步驟多，收率低。本文研究了通過在大腸桿菌中融

3、合表達(dá)而制備reCPI的新方法。 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到CPI的編碼基因，克隆于表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)中，得到重組質(zhì)粒pGCPI，測序后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌EscherichiacoliBL21中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)37℃培養(yǎng)2h，在0.2mmol/L的IPTG存在下，于37℃誘導(dǎo)4h，重組E.coliBL21(pGCPI)可合成約占菌體總蛋白22.6％的可溶性reCPI-GST融合蛋白。 通過在搖瓶條件下的優(yōu)

4、化，得到最佳培養(yǎng)和表達(dá)條件為：LB培養(yǎng)基中，接種量為5％，經(jīng)37℃培養(yǎng)至A600為0.5-0.7時(shí)添加終濃度為0.2mmol/L的IPTG，在30℃持續(xù)誘導(dǎo)5小時(shí)進(jìn)行表達(dá)。通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到經(jīng)濟(jì)適用、易于擴(kuò)大培養(yǎng)重組菌的培養(yǎng)基配方：葡萄糖10g/L，硫酸銨1g/L，蛋白胨3g/L，檸檬酸2g/L，磷酸二氫鉀15g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，TES5mL/L；pH為7.0。在3.7L臺(tái)式攪拌發(fā)酵罐中，控制溶氧在30％以上

5、，重組菌的對(duì)數(shù)生長中期流加碳源和氮源，最終菌體光密度A600達(dá)到52.4，菌體干重為26.2g/L，目的蛋白的表達(dá)量達(dá)到24.8％。 利用谷胱甘肽SepharoseFF親和層析、凝血酶切割、谷胱甘肽SepharoseFF親和層析、超濾這四步簡易而方便的操作，成功地將短肽reCPI分離純化出來。通過該方法，可以從500mL發(fā)酵液中提取出reCPI698μg，純度為98.9％，得率達(dá)60.5％。通過測定reCPI的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)其