轉CD14基因shRNA小鼠模型的制備.pdf

1、CD14為白細胞分化抗原14，是革蘭氏陰性菌內毒素LPS的高親和受體。CD14能夠識別且結合LPS，參與革蘭氏陰性菌的消化和吞噬作用，觸發(fā)機體產生免疫應答。為研究CD14基因在體內的表達抑制對相關基因表達及動物個體發(fā)育影響、建立抗革蘭氏陰性菌小鼠模型，本研究利用已篩選并進行抑制效果驗證的CD14基因shRNA片段，構建真核表達載體，通過原核注射法制備轉CD14基因shRNA轉基因小鼠，對轉基因小鼠進行分析鑒定。鑒于真核表達載體制備轉基因

2、動物效率不高的問題，本研究還初步探討了慢病毒載體法制備轉基因小鼠相關影響因素及其對轉基因效率的影響，為高效制備慢病毒介導的轉基因小鼠奠定基礎。
　　 1.原核注射法生產轉CD14基因shRNA小鼠模型
　　 選擇已篩選并進行抑制效果驗證的CD14基因shRNA片段，將其連接插入pSlience4.1-CMV neo載體中，同時連接插入hEF1a-EGFP-IRES-neo-pA片段，構建真核表達載體pSilencer4.

3、1-CD14 shRNA-IRES。采用原核注射的方法得到37只原代小鼠（F0代），經PCR鑒定，3只為轉基因陽性鼠。通過擴繁獲得33只F1代小鼠，經PCR、Southern-blotting檢測發(fā)現，11只為轉基因陽性。采用組織切片法，對F1代部分小鼠的主要臟器進行了分析，結果發(fā)現，外源轉EGFP標記蛋白在肝臟、腎和脾臟表達，且在脾臟的表達量最高。說明獲得的為嵌合體轉基因小鼠。采用實時熒光定量PCR方法檢測F1代轉基因小鼠CD14基因

4、的表達，結果顯示，相對于陰性小鼠，CD14基因在轉基因陽性小鼠的心、肝、脾、肺、腎組織表達分別降低了8倍、3倍、19.5倍、6倍和11倍，表明轉基因陽性小鼠體內，CD14基因shRNA對部分組織中的CD14基因表達具有顯著的抑制作用。
　　 2.CD14基因shRNA慢病毒載體對小鼠胚胎發(fā)育及轉基因效率的影響
　　 采用兩種水牛CD14基因shRNA的慢病毒表達載體pSicoR-GFP-buffalo-U6-shRNA、

5、pSicoR-GFP-human-U6-shRNA，通過卵周隙注射法探討病毒滴度、注射時期、不同U6啟動子的慢病毒載體對小鼠胚胎發(fā)育及轉基因效率的影響。結果顯示:1×106 IU/mL～1×109 IU/mL滴度的病毒均能感染小鼠胚胎，4組間胚胎的分裂率無顯著差異(P＞0.05)，1×106 IU/mL、1×107IU/mL、1×108 IU/mL組的囊胚率也無顯著差異(P＞0.05)，1×109 IU/mL組的囊胚率顯著低于其他三組(

6、P＜0.05)，各組囊胚轉EGFP基因陽性率差異顯著(P＜0.05)，感染小鼠胚胎較合適的慢病毒滴度為1×108 IU/mL。當用慢病毒感染1-細胞和2-細胞期胚胎時，兩組間的胚胎分裂率、囊胚率、囊胚陽性數均無顯著差異(P＞0.05)，2-細胞注射組的胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚陽性數均比注射1-細胞組的高，表明注射小鼠胚胎的較佳時期以2-細胞期較好。采用水牛源U6和人源U6啟動子病毒注射1-細胞期小鼠胚胎時，兩組間的胚胎卵裂率、囊胚率和囊

7、胚陽性率均無顯著差異(P＞0.05)，但人源U6啟動子組的囊胚陽性率高于水牛源U6啟動子組(96.4％ VS83.5％)。兩種U6啟動子注射組所得囊胚的EGFP表達實時熒光定量PCR檢測結果發(fā)現，人源U6組囊胚的EGFP表達量是水牛源U6組的5.6倍，表明含有人源U6的慢病毒載體結構的整合效率高于水牛源U6的慢病毒載體結構。
　　 結論:原核注射法獲得的CD14基因shRNA轉基因小鼠可穩(wěn)定遺傳外源基因，其內源CD14基因表達顯