藥物熱原檢測平臺—TLR4、MD2及CD14基因穩(wěn)定表達細胞系的構建.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分
　　目的：
　　采用基因工程和分子生物學的方法，構建體外穩(wěn)定表達的Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化蛋白-2（MD2）和白細胞分化抗原14（CD14）基因細胞學模型，為醫(yī)用注射類藥物的熱原檢測提供一種簡便可行的實驗室技術方法。
　　方法：
　　1.目的基因的克?。阂詐cDNA.3.1-TLR4-YFP質(zhì)粒為模板，大體系PCR得到TLR4的DNA片段，回收PC

2、R產(chǎn)物連接于pMD19-T載體上進行克隆。取人外周血單核細胞總RNA，利用RT-PCR得到MD2和CD14的DNA片段，回收PCR產(chǎn)物連接于pMD19-T載體上進行克隆。
　　2.表達載體的構建：經(jīng)過基因序列分析鑒定的pMD19-T-TLR4與pCAG-GFP表達載體同時進行KpnI和SmaI雙酶切，將回收片段進行連接，構建成pCAG-GFP-TLR4表達載體質(zhì)粒；pMD19-T-MD2克隆載體與pCAG-GFP表達載體同時進行K

3、pnI和EcoRI雙酶切，將回收片段進行連接，構建成pCAG-GFP-MD2表達載體質(zhì)粒；pMD19-T-CD14載體質(zhì)粒與pCAG-GFP載體質(zhì)粒同時進行KpnI和EcoRI雙酶切，將回收片段進行連接，構建成pCAG-GFP-CD14載體質(zhì)粒。
　　3.質(zhì)粒的轉染及表達檢測：構建成功的pCAG-GFP-TLR4、pC AG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14表達載體質(zhì)粒通過電轉染的方法轉染至PC-3M、HIT細胞系，轉染

4、后培養(yǎng)細胞48h，在熒光倒置顯微鏡下觀察GFP的表達情況。
　　結果：
　　1.利用pcDNA.3.1-TLR4-YFP質(zhì)粒為模板成功獲得人TLR4的DNA，成功構建pMD19-T-TLR4克隆載體質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序及BLAST鑒定序列無誤。
　　2.利用RT-PCR成功獲得人MD2和CD14的DNA，成功構建pMD19-T-MD2、pMD19-T-CD14克隆載體質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序及BLAST鑒定序列無誤。
　

5、　3.成功構建pCAG-GFP-TLR4、pCAG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14表達載體質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序及BLAST鑒定序列無誤。
　　4.將構建成功的pCAG-GFP-TLR4、pCAG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14表達載體質(zhì)粒通過電轉染的方法轉染至PC-3M、HIT細胞后，培養(yǎng)細胞48h，在熒光倒置顯微鏡下細胞觀察到了GFP的表達，表明質(zhì)粒在體外培養(yǎng)條件下成功表達。
　　結論：
　　成

6、功構建與熱原反應相關基因的表達載體，即人TLR4、MD2和CD14基因的真核表達載體pCAG-GFP-TLR4、pCAG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14，并將其轉染入PC-3M、HIT細胞獲得表達，為構建熱原檢測細胞模型做好了前期準備。
　　第二部分
　　目的：
　　觀察四種經(jīng)化學合成的三萜類新化合物（命名為H0801、H0805、H0806、H0811）對順鉑(DDP)誘導大鼠急性腎損傷保護作用并探討對其

7、可能作用機制。
　　方法：
　　1.觀察四種三萜類新化合物對順鉑誘導大鼠急性腎損傷保護作用
　?、俨捎庙樸K(6mg/kg)單次腹腔注射的方法制造順鉑腎毒性模型。
　　②給藥期間監(jiān)測大鼠飲食、飲水、毛色及體重變化情況，并于造模后第5天稱重，采血，處死動物。
　?、厶幩来笫蠛?，取兩側腎臟，稱重，計算腎臟系數(shù)。
　?、苤苽淠I組織切片，進行碘酸六胺銀（Periodic acid-silver metheram

8、ine, PASM）染色，拍照并進行組織形態(tài)學觀察。
　　⑤檢測血清中的血清尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）及肌酐（Serum creatinine，Scr）含量。
　　2.探討四種三萜類新化合物對順鉑誘導大鼠急性腎損傷保護作用可能的作用機制。
　　檢測三萜類新化合物對大鼠腎組織勻漿中丙二醛(Malondia lde hyd e，MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione pero

9、xidase，GSH-PX)活性和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性的影響。
　　結果：
　　1.三萜類新化合物對順鉑誘導大鼠急性腎損傷保護作用
　　與生理鹽水（NS）組相比，順鉑（DDP）模型組大鼠體重進行性下降，腎臟系數(shù)增加，腎組織病理改變明顯，血清中的BUN及Scr含量顯著性增高(P<0.01)。四種三萜類新化合物治療組對上述情況均有不同程度的改善作用。H0805治療組可以使血

10、清中BUN含量降低(P<0.05)；各三萜類新化合物治療組均可顯著性地使大鼠血清中的Scr含量下降(P<0.01)。
　　2.三萜類新化合物對順鉑誘導大鼠急性腎損傷保護作用可能的機制
　　與NS組相比，DDP模型組大鼠腎組織勻漿中的MDA含量增加(P<0.01);同時抑制GSH-PX和SOD活性(P<0.01,P<0.01)。而H0801和H0806可以明顯提高SOD(P<0.01)，GSH-Px的活性(P<0.01)，降低