三種水稻病毒基因沉默抑制子的鑒定和研究.pdf

1、在植物及多種真核生物中，基因沉默是一種保守的抗病毒機(jī)制。為對付這種防御機(jī)制，大多數(shù)植物病毒及一些動物病毒編碼-或多個(gè)基因沉默抑制子。水稻是我國最重要的糧食作物之一。病毒病一直是威脅水稻生產(chǎn)的一個(gè)重要因素。近年來，水稻鋸齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus，RRSV)和南方黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)的流行給我國水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失

2、。
　　 本實(shí)驗(yàn)克隆了RRSV和SRBSDV兩種病毒非結(jié)構(gòu)蛋白全長ORF，并分別將它們連接到pPZP212或pEarleyGate100載體，將所得質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，然后分別與攜帶有35S-GFP的農(nóng)桿菌混合，注射本氏煙16c。在注射后第3天，所有注射區(qū)域均出現(xiàn)了較強(qiáng)的綠色熒光。但只有在共注射35S-RRSVS6加35S-GFP或35S-SRBSDVS6加35

3、S-GFP的區(qū)域中，熒光強(qiáng)度一直持續(xù)到第7天。另外，在共表達(dá)RRSV S6突變體加35S-GFP的區(qū)域中，熒光強(qiáng)度從第3天開始出現(xiàn)下降，到第7天基本消失。在注射后第7天，GFP的mRNA在共表達(dá)RRSV的Pns6和35S-GFP的區(qū)域中大量積累，而此時(shí)，在這些區(qū)域中，GFP對應(yīng)的siRNA基本檢測不到。把RRSV的Pns6連接到馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)上后，該蛋白能顯著增強(qiáng)PVX的致病性。從這些結(jié)果中，本實(shí)驗(yàn)

4、推斷RRSV和SRBSDV的Pns6具有基因沉默抑制子活性。進(jìn)一步的分析表明RRSV的Pns6不能抑制由雙鏈GFP誘導(dǎo)的沉默。并且，在缺失一段對核酸結(jié)合必須的區(qū)域后，Pns6不再具有抑制子活性。在本氏煙(Nicotiana benthamiana)葉片表皮細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，RRSV的Pns6主要定位于細(xì)胞周圍，并形成一些可區(qū)分的小點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室已有研究結(jié)果表明RRSV的Pns6可能為一運(yùn)動蛋白。Pns6的多功能性促使我們以其為

5、誘餌，運(yùn)用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了水稻cDNA文庫的篩選。對經(jīng)過篩選而得到的陽性克隆，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了測序，序列分析表明，至少有44個(gè)水稻蛋白可能與RRSV的Pns6存在著互作。本實(shí)驗(yàn)對這些蛋白按GO注釋進(jìn)行了分類，結(jié)果表明這些蛋白在功能上具有著很大的多樣性。
　　 本實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明，水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)的p2可以與水稻的SGS3(OsSGS3)互作。并且在 RSV侵染的水稻中，5個(gè)可以被 T

6、AS3產(chǎn)生的反式作用小干擾RNA識別的生長素響應(yīng)因子基因在表達(dá)上出現(xiàn)了上調(diào)，這表明RSV的侵染可能影響了水稻的反式作用小干擾RNA途徑。本實(shí)驗(yàn)開展了一些旨在進(jìn)一步了解p2與OsSGS3互作的生物學(xué)意義的研究，并得到以下結(jié)果：1)RSV的p2是-基因沉默抑制子，它能抑制由單鏈GFP誘導(dǎo)的基因沉默并能顯著增強(qiáng)PVX的致病性。2)在RSV侵染的水稻中，生長素相關(guān)基因并沒有發(fā)生一致的上調(diào)，這表明在本實(shí)驗(yàn)室先前的研究中，反式作用小RNA靶標(biāo)基因上