柑橘脈突病毒侵染性克隆構建及其基因沉默抑制子鑒定.pdf

1、柑橘脈突病毒（Citrus vein enation virus，CVEV）是黃矮病毒科（Luteoviridae）豌豆耳突花葉病毒屬（Enamovirus）的一種正義單鏈RNA病毒，引起柑橘脈突病及木瘤病。目前，CVEV在西班牙、南非、澳大利亞、巴西、印度、美國、秘魯和土耳其等多個國家均有發(fā)生，在我國主要分布于浙江黃巖地區(qū)。由于該病毒能由多種蚜蟲傳播，因而具有一定的傳播流行風險。為保障我國柑橘產(chǎn)業(yè)安全，本研究在建立CVEV實時熒光定量

2、RT-PCR檢測方法的基礎上，構建CVEV全長cDNA克隆，分析其侵染性，并開展了CVEV基因沉默抑制子的鑒定，以期為CVEV的流行監(jiān)控、分子生物學及致病機理研究奠定基礎。所取得的主要研究結果如下：
　　1.CVEV實時熒光定量RT-PCR檢測體系的建立
　　本研究通過設計特異性引物（EVqF4/EVqR4），優(yōu)化反應條件，建立了CVEV實時熒光定量RT-PCR檢測體系。該方法特異性良好；靈敏度較高（為常規(guī)RT-PCR的10

3、0倍）；標準曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.992，擴增效率為101.8%；檢測組間和組內(nèi)變異系數(shù)均不超過2.85%，重復性較好，適用于檢測田間樣品。
　　2.CVEV在代代酸橙植株中的時空分布
　　應用所建立的實時熒光定量RT-PCR檢測體系對CVEV在代代酸橙中的時空分布進行檢測。結果表明，CVEV在代代酸橙根中，無論春季、夏季或者秋季，其含量相對于其它部位最高，其次是嫩皮；另外，嫩葉、嫩皮和老皮中

4、CVEV含量在春季最高，春、夏、秋依次減少。
　　3.構建CVEV全長cDNA克隆及其序列分析
　　本研究建立了CVEV全基因組一步法RT-PCR擴增體系，并成功獲得其全長cDNA克隆36個。序列比對結果顯示，本研究所獲CVEV全長基因組序列（命名為CVEV-XSH）與已報道的VE-1分離株基因組序列相似度最高，為98.61%；與豌豆耳突花葉病毒-1（Pea enation mosaic virus-1，PEMV-1）和紫花

5、苜蓿耳突病毒（Alfalfa enamovirus-1，AEV）曼菲蒂分離株序列進行比對，其一致性分別為90.46%和90.26%，表明CVEV-XSH基因序列相對保守。根據(jù)全基因組序列構建的進化樹顯示，CVEV-XSH與VE-1、PEMV-1、AEV曼菲蒂分離株聚為一簇，與序列相似性分析結果一致。
　　4.CVEV全長cDNA克隆侵染性分析
　　采用農(nóng)桿菌介導的本生煙接種法，對獲得的36個CVEV全長cDNA克隆進行了侵染

6、實驗。生物學觀察以及分子檢測結果顯示未獲得侵染性克隆。為此，本研究進一步設計實驗，旨在發(fā)掘影響其侵染性的因素。首先，利用5'Race技術獲得末端序列，并對其變異情況進行分析；結果顯示，CVEV5'端序列保守性極高，未發(fā)現(xiàn)變異存在。其次，采用與CVEV全長cDNA克隆相同的方法構建PVX全長cDNA克隆，成功獲得PVX全長cDNA侵染性克隆，說明本研究所用雙元表達載體pXT1以及構建方法均有效。第三，為避免重組質粒在大腸桿菌中存在不穩(wěn)定現(xiàn)

7、象而造成侵染失敗問題，本研究將CVEV全長基因PCR產(chǎn)物與表達載體pXT1連接后，直接轉化農(nóng)桿菌初步得到4個陽性克隆，接種后經(jīng)分子檢測仍未篩選出侵染性克隆。第四，篩選其它草本寄主，即采用毒源葉片汁液摩擦接種豌豆、蠶豆、蕓豆、昆諾藜等草本植株，結果顯示均未表現(xiàn)出侵染性。綜上表明，CVEV全長cDNA克隆侵染失敗并非5'末端序列變異、表達載體以及構建方法所致，而針對重組質粒在大腸桿菌中不穩(wěn)定以及寄主影響，或者其它原因造成的侵染失敗，還需進一

8、步分析探究。
　　5.CVEV基因沉默抑制子的初步鑒定
　　本研究在克隆CVEV5個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）編碼基因的基礎上，構建其重組雙元表達載體，并利用農(nóng)桿菌介導的病毒微型復制子（p35miniBYV-eGFP）共浸潤鑒定法開展了沉默抑制子鑒定試驗。結果顯示：CP表達載體共注射本生煙植株各重復均出現(xiàn)綠色熒光，其熒光強度較負對照強，但與正對照HC-Pro相比較弱，說明CP具有一定的基因沉默