擬南芥FRIGIDA-LIKE蛋白家族居員AtFRL4基因及其上游調(diào)控序列的克隆與轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、開(kāi)花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過(guò)渡的重要標(biāo)志，是植物完成生活周期的重要階段。對(duì)植物開(kāi)花機(jī)制的研究可為牧草及種子生產(chǎn)提供依據(jù)，有利于人們根據(jù)生產(chǎn)生活需要進(jìn)行合理的利用。本研究針對(duì)一個(gè)FRIGIDA-LIKE蛋白家族成員AtFRL4基因（座位號(hào):At4g14900）及其上游啟動(dòng)子AtFLP進(jìn)行研究，以期確定該基因的功能，探明其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　 從NCBI中檢索得到AtFRL4基因的編碼區(qū)序列，并利用PCR法分離得到其全長(zhǎng)。A

2、tFRL4基因cDNA全長(zhǎng)1934bp，與FRI(At4g00650)存在38.9％的同源性。其編碼的蛋白包含532個(gè)氨基酸，與FRI具有24％的同源性，具有FRIGIDA多結(jié)構(gòu)域和WWbp結(jié)構(gòu)域，為富含羥脯氨酸糖蛋白，屬于FRIGIDA-LIKE蛋白家族。
　　 同時(shí)，為了解AtFRL4蛋白在植物細(xì)胞中的定位情況，構(gòu)建AtFRL4與GFP基因融合的表達(dá)載體pA7-GFP-AtFRL4。通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，利用CaMV3

3、5S啟動(dòng)子調(diào)控融合蛋白在細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。GFP熒光檢測(cè)結(jié)果表明:融合蛋白在細(xì)胞核集中表達(dá)，在細(xì)胞膜表達(dá)量較少。
　　 為確定AtFRL4基因的功能，本研究構(gòu)建AtFRL4與報(bào)告基因GUS融合的超表達(dá)載體pBI-AtFRL4，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，使其在煙草中過(guò)量表達(dá)來(lái)探索其功能，驗(yàn)證其對(duì)開(kāi)花的影響。通過(guò)對(duì)具有卡那霉素抗性的幼苗進(jìn)行DNA與RNA水平的PCR檢測(cè)，最終獲得了9株含有AtFRL4目的基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株。通過(guò)對(duì)該

4、9株AtFRL4轉(zhuǎn)基因T0代再生植株進(jìn)行開(kāi)花統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因可能參與植物開(kāi)花調(diào)控，具有推遲開(kāi)花的作用。
　　 為研究?jī)?nèi)外環(huán)境對(duì)AtFRL4基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，利用PCR法分離得到AtFRL4基因上游1690bp的啟動(dòng)子序列AtFLP。經(jīng)預(yù)測(cè)該段序列包含光照，溫度，激素等多種順式作用元件，且可能與開(kāi)花調(diào)控相關(guān)。本研究以基因自身啟動(dòng)子AtFLP片段代替異源CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子，構(gòu)建AtFLP啟動(dòng)子與GUS融合的表達(dá)載體pB