Modified Cry3A α同源基因轉(zhuǎn)化楊樹(shù)湘林系列無(wú)性系的研究.pdf

1、本研究以楊樹(shù)湘林系列無(wú)性系(XL－80、XL－77和XL－90)葉片為材料，在建立高效組培再生體系的基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，開(kāi)展了Modified Cry3Aa同源基因Cry3Aa1#和Cry3Aa2#的遺傳轉(zhuǎn)化研究，取得的主要進(jìn)展如下：
　　 1.湘林系列無(wú)性系葉片高頻組培再生體系的建立
　　 (1)XL－80最佳不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.005mg·L-

2、1 TDZ，分化率達(dá)95％；最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+0.5mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3，增殖系數(shù)為5.8；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg·L-1NAA，生根率為100％，根系質(zhì)量最好，幼苗生長(zhǎng)健壯。
　　 (2)XL-77最適誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-16-BA+0.15 mg·L-1NAA+0.005 mg·L-1TDZ，誘導(dǎo)率達(dá)95.8％；最佳伸長(zhǎng)培養(yǎng)基

3、為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg·L-1NAA，根系發(fā)達(dá)，茁高約3.5～6.5cm，葉細(xì)長(zhǎng)，葉色深綠。
　　 (3)XL-90最適誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS+0.5mg·L-16－BA+0.1mg·L-1NAA+0.01mg·L-1TDZ，誘導(dǎo)率達(dá)96.3％；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-16－BA+0.1mg·L-1NAA，增殖系數(shù)達(dá)到7.4，無(wú)菌苗生

4、長(zhǎng)健壯；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg·L-1IBA，生根率達(dá)100％，根系較粗，側(cè)根明顯，幼苗生長(zhǎng)健壯。
　　 2.湘林－77、湘林－90遺傳轉(zhuǎn)化中選擇壓的確定
　　 篩選標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NptⅡ)基因，遺傳轉(zhuǎn)化中采用Km作為篩選轉(zhuǎn)化植株的選擇劑。經(jīng)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明：XL－77分化培養(yǎng)基添加30mg·L-1Km、生根階段添加濃度為40mg·L-1Km為宜；XL－90分化培養(yǎng)基添加20mg·L-1K

5、m、生根階段添加濃度為30mg·L-1Km較為合適。
　　 3.湘林－77、湘林－90遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
　　 采用導(dǎo)入pBI121－2k質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化XL－77、XL－90葉片，研究單因素對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化Cry3Aa1#基因的最優(yōu)條件為預(yù)培養(yǎng)3d、侵染20min、共培養(yǎng)4d、AS不需添加；轉(zhuǎn)化Cry3Aa2#基因的最優(yōu)條件為預(yù)培養(yǎng)3d、侵染20min、共培養(yǎng)3d、AS濃度為160umol·L

6、-1。
　　 4.湘林－77、湘林－90轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植株的獲得和分子檢測(cè)
　　 在經(jīng)Km嚴(yán)格篩選獲得轉(zhuǎn)化XL－77的共有14株含Cry3Aa1#基因Kmr抗性芽、7株含Cry3Aa2#基因Kmr抗性芽；轉(zhuǎn)化XL-90共有5株含Cry3Aa1#基因Kmr抗性芽、3株含Cry3Aa2#基因Kmr抗性芽。對(duì)再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果共篩選6株(XL-77:2株轉(zhuǎn)Cry3Aa1#基因Kmr抗性芽，1株轉(zhuǎn)Cry3Aa2#基因Kmr