楊樹CCR基因RNAi表達載體的構建及其轉化研究.pdf

1、木質素是地球上數(shù)量僅次于纖維素的有機物,林木中木質素占木材干重的15％～36％,木質素生物合成及調節(jié)在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用,另一方面,木質素是制漿造紙業(yè)的不利因素,脫除纖維素中的木質素,需要消耗大量能源和使用有毒化學物質,提高了造紙成本并污染環(huán)境。近十幾年來,隨著人們對木質素生物合成研究的深入,木質素生物合成途徑許多酶的編碼基因被不斷分離克隆出來,調控木質素生物合成途徑中重要酶基因的表達,通過抑制酶的活性,從而阻斷木質素生物合成

2、途徑,降低木質素的合成量或單體組成,已經在煙草和楊樹等植株上取得了成功。因此,利用生物技術手段降低木質素含量或改變其組成,提高楊樹的制漿性能,創(chuàng)造出符合造紙原料要求的林木品種,對于降低制漿造紙的經濟成本和保護環(huán)境等都具有重要意義。CCR是木質素生物合成途徑的關鍵酶之一,在木質素生物合成途徑中處于終端位置。RNAi是一種重要的基因沉默方式,在植物基因功能和遺傳改良研究中廣泛應用。為優(yōu)化和建立楊樹遺傳轉化體系,探討RNAi技術在楊樹木質素改

3、良中的應用效果,建立楊樹RNAi的分子育種新方法,本文以南林95葉片為外植體,對農桿菌介導的遺傳轉化體系進行較系統(tǒng)地研究,構建了肉桂酰輔酶A還原酶基因CCR干涉表達載體pBI121+2F,開展了農桿菌介導的楊樹遺傳轉化,并對轉化植株進行了篩選、PCR檢測和木質素含量檢測,獲得了如下主要結果： 1、采用改良的CTAB法提取南林95的基因組DNA,利用PCR技術克隆得到CCR基因的第4個外顯子部分序列,并將其正向和反向克隆到pUCC

4、RNAi載體上,通過酶切、純化、連接、轉化等一系列基因工程操作方法構建了含CaMV35S組成型啟動子和卡那霉素篩選基因的RNAi表達載體pBI121+2F,并將其成功的導入農桿菌LBA4404中。 2、以南林95為試材,對其葉片再生體系進行了優(yōu)化,建立了高效的葉盤法農桿菌遺傳轉化體系,并獲得了經抗Kan篩選的RNAi片段的轉基因植株。 3、對獲得的轉基因植株進行PCR,檢測,獲得了RNAi片段的轉基因植株。對培養(yǎng)3個月的