添加延胡索酸二鈉對湖羊瘤胃發(fā)酵和菌群結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、反芻動物瘤胃中的甲烷菌利用飼料發(fā)酵過程中生成的氫和CO2作為主要的電子受體和供體通過還原反應(yīng)生成甲烷，在瘤胃功能性生態(tài)生境中發(fā)揮重要作用.除甲烷菌以外，其他瘤胃微生物也影響甲烷產(chǎn)量。瘤胃微生物總體來說可分為產(chǎn)氫微生物和耗氫微生物兩大類。通過構(gòu)建克隆文庫等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，闡述氫代謝相關(guān)微生物數(shù)量和多樣性，并著重研究瘤胃內(nèi)與降低甲烷產(chǎn)生過程密切相關(guān)的耗氫微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，從微觀角度研究添加延胡索酸鹽對湖羊瘤胃氫代謝相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)的影響。

2、r>　　 第一部分延胡索酸二鈉添加對湖羊瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系總體變化趨勢的影響
　　 本部分通過體外和體內(nèi)試驗研究延胡索酸二鈉添加對湖羊瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系的研究。大量研究已證實茶皂素能夠減少瘤胃內(nèi)氫產(chǎn)生菌(原蟲)數(shù)量和活性，而延胡索酸鈉能提高瘤胃內(nèi)氫利用菌的數(shù)量和活性(延胡索酸還原菌)，推測兩者混合添加能從兩方面降低瘤胃內(nèi)氫壓，從而起到降低瘤胃甲烷產(chǎn)量的作用。通過體外茶皂素和延胡索酸二鈉的混合添加試驗，發(fā)現(xiàn)茶皂素和延胡索酸鈉

3、混合添加時，對產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量和乙酸丙酸比有良好的互作效果。在此基礎(chǔ)上了進行湖羊試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加延胡索酸二鈉30g/d連續(xù)飼喂6周，發(fā)現(xiàn)最后一周時丙酸顯著增加。同時發(fā)現(xiàn)延胡索酸二鈉添加顯著降低了甲烷菌(氫利用菌)數(shù)量、提高了主要纖維降解細菌(氫產(chǎn)生菌)R.albus和廷胡索酸還原菌F.succinogenes的數(shù)量，同時對真菌(氫產(chǎn)生菌)也有促進作用。DGGE分析發(fā)現(xiàn)DGGE分析發(fā)現(xiàn)，隨著延胡索酸二鈉的添加細菌區(qū)系有從擬桿菌門變?yōu)楸?/p>

4、厚菌門的趨勢。
　　 第二部分添加延胡索酸二鈉對湖羊瘤胃細菌菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　 本部分取上述試驗中的0周(對照組)和6周(處理組)的瘤胃液樣品構(gòu)建16S rRNA基因總菌文庫，探討了添加延胡索酸二鈉對湖羊瘤胃細菌菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)對照組文庫共255個克隆中有73％的克隆屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)，24％的克隆屬于壁厚菌門(Firmicutes)。而延胡索酸處理組共231個克隆中有10％的克隆屬于壁

5、厚菌門，82％的克隆屬于擬桿菌門，還有4％的克隆屬于proteobacteria(蛋白分解菌門)，推測蛋白分解菌門在延胡索酸還原過程中起著關(guān)鍵作用。對照組箘群(OTU)個數(shù)為75個，添加后增加為153個。兩個文庫合并分析共得到208個valid OTUs。兩個文庫的coverage值分別是79％和51％。說明處理組還有很多新的菌群尚未發(fā)現(xiàn)。在處理組中還發(fā)現(xiàn)12個序列屬于Butyrivibrio(丁酸弧菌屬)，其中有3個克隆屬于Butyr

6、ivibrio fibrisolvens(溶纖維丁酸弧菌)，同源性為93％。還有8個序列屬于Butyrivibrio hungatei(亨氏丁酸弧菌)，相似性為99％。剩下9個屬于Butyrivibrio proteoclasticus，相似性為95％。而對照組中只發(fā)現(xiàn)2個序列屬于丁酸弧菌屬(id=95％)?？梢娧雍魉崽砑哟龠M了丁酸弧菌屬的生長。說明這個屬的菌在延胡索酸代謝途中發(fā)揮著某種積極作用。作為纖維分解菌和丁酸生成菌Butyri

7、vibrio fibrisolvens的增加，表明添加延胡索酸鈉鹽后提高了纖維降解能力。另外還發(fā)現(xiàn)對照組中有163個克隆屬于Prevotella屬的細菌，而處理組只有15個克隆與Prevotella相似，說明隨著延胡索酸鈉鹽的添加Prevotella屬的細菌的優(yōu)勢性大大降低，可能由其他與廷胡索酸代謝相關(guān)的菌代替成為優(yōu)勢菌群。另外處理組中27個克隆屬于Clostridium-like菌(id=86％)，而對照組只有6個克隆與Clostri

8、dium-like菌相似(相似性為86％)。與DOGE結(jié)果對應(yīng)，說明Clostridium-like菌在廷胡索酸代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　 延胡索酸鈉添加顯著提高了瘤胃細菌的多樣性，并在各個分類水平上顯著改變了瘤胃細菌的菌群結(jié)構(gòu)。
　　 第三部分添加延胡索酸二鈉對湖羊瘤胃甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　 本部分通過構(gòu)建對照組和添加延胡索酸鈉鹽組的瘤胃16S rRNA基因甲烷菌文庫，比較mcrA文庫和Archaeal

9、16S rRNA基因文庫反映瘤胃甲烷菌結(jié)構(gòu)的異同，從而結(jié)合兩種文庫探討添加延胡索酸二鈉是否對湖羊瘤胃甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mcrA文庫和Archaeal16S rRNA基因文庫構(gòu)建的進化樹結(jié)構(gòu)相似，說明mcrA文庫可以在一定程度上替代Archaeal16S rRNA基因文庫來檢測瘤胃甲烷菌多樣性。兩個Archaeal16S rRNA基因文庫共有序列340個克?。浩渲袑φ战M158個，處理組182個。從rRNA進化樹上，古菌界(A

10、rchaea)分為兩大門，泉古菌門(crenarchaeota)和廣古菌門(Euryarchaeota)。本研究檢測到湖羊瘤胃甲烷古菌都屬于廣古菌門(Euryarchaeota)、甲烷桿菌綱(Methanobactcria)。本研究基于97％相似度為臨界值，發(fā)現(xiàn)對照組湖羊瘤胃Archaeal16S rRNA基因文庫可劃分為17個OTU，包括4個優(yōu)勢菌群(成員大于10個)，第一個優(yōu)勢菌群屬于Methanobrevibacter olley

11、ae，有46個克隆，同源性98％。第二優(yōu)勢菌群屬于Mbb.millerae，有37個成員，同源性為97％。第三個優(yōu)勢箘群為Mbb.ethanobrevibacter thaueri，有26個克隆，同源性為97％。第四優(yōu)勢菌群為Mbb.millerae，有24個成員，同源性97％。處理組則可分為6個OTU，共有2個優(yōu)勢菌群。第一優(yōu)勢菌群Mbb.millerae，有124個成員，相似性為98％。第二優(yōu)勢菌群為Mbb.Olleyae，有51個

12、克隆，相似性為98％。所以添加延胡索酸鈉降低了甲烷菌菌群的數(shù)量，由17個減少為6個。其中一個優(yōu)勢菌群變得更加優(yōu)勢，成員顯著增加。
　　 Mbb.olleyae和Mbb.Millerae是湖羊瘤胃優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌。延胡索酸鈉鹽的添加在“種”的水平上改變了瘤胃甲烷菌群的結(jié)構(gòu)，菌群多樣性降低，但優(yōu)勢菌群變得更加集中，Mbb。Millerae數(shù)量顯著增加，發(fā)揮主要功能。
　　 第四部分延胡索酸鈉添加對其還原酶frda基因文庫多樣性的

13、影響
　　 本研究通過不同調(diào)控方式探討延胡索酸鈉對其其還原酶frdA基因文庫多樣性的影響。首先對上述動物試驗對照組和處理組分別構(gòu)建Proteobacteria(變形菌門)延胡索酸還原酶基因fumarate reductase(frdA)克隆文庫，進行frdA基因多樣性分析，共得到118個核苷酸序列，其中動物對照組60個，處理組58個。經(jīng)mothur分析后，發(fā)現(xiàn)在unique水平動物試驗不添加延胡索酸鈉組共有37個OTU，處理組共

14、有38個OTU。發(fā)現(xiàn)湖羊瘤胃中的fumarate-reducing Proteobacteria主要有以下五大菌簇(clusters)：ClusterⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，分別屬于Proteus mirabilis，Vibrio furnissii，Shewanella sp.，Photobacterium sp.，和Mitsuokella multacida Sdh。添加延胡索酸二鈉組的菌群結(jié)構(gòu)較對照組發(fā)生顯著變化，對照組奇異變形菌(P

15、roteus mirabilis)占主導(dǎo)地位，添加廷胡索酸二鈉后弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)占主導(dǎo)地位。本研究中所有frdA序列在進化樹中都與gammaproteobacteria在同一個分支，說明所有序列都屬于gammaproteobacteria。富集試驗中采用不同電子供體(甲酸或氫)，以延胡索酸二鈉為電子受體，進行fumarate reducing Proteobacteria富集培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Proteus mira

16、bilis是與動物試驗文庫中共享的一個OTU(菌簇)。不同電子供體能顯著影響富集物中fumarate reducing Proteobacteria菌群結(jié)構(gòu)的變化。氫和甲酸為電子供體時，frdA文庫以Escherichia coil為主要優(yōu)勢菌群；氫為電子供體時，frdA文庫以Proteus mirabilis為主要優(yōu)勢菌群，而且此菌群和動物試驗frdA文庫是共享菌群。富集培養(yǎng)試驗frdA文庫序列與已知菌相似性高，揭示出富集試驗趨向于得

17、到相對較容易培養(yǎng)出來(relatively easy-to-culture)的菌種。還發(fā)現(xiàn)體內(nèi)富集文庫與已報道的牛瘤胃Bovine-rumen cluster的分支進化距離很近，而只檢測到體外富集試驗添加氫為電子供體文庫中的一個克隆(EH-OTU3)屬于Hu-sheeprumen cluster，其他所有的體外富集文庫與動物文庫進化距離較遠，從進化樹的角度反映了體內(nèi)和體外富集廷胡索酸還原菌的差異。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)湖羊瘤胃中發(fā)現(xiàn)大量Vibri

18、o-relatedspecies。正常瘤胃條件下(0周)，發(fā)揮功能的主要fumarate-reducing Proteobacteria菌群屬于Proteus mirabilis。而添加延胡索酸6周后，主要功能菌群變?yōu)閂ibrio furnissii，Vibriofurnissii的優(yōu)勢程度從0周的18％增加到6周的50％。還發(fā)現(xiàn)6周時出現(xiàn)了一個新的菌種：Shewanella sp.。然而Proteus mirabilis的優(yōu)勢程度從0