添加延胡索酸二鈉對(duì)湖羊瘤胃發(fā)酵和菌群結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、反芻動(dòng)物瘤胃中的甲烷菌利用飼料發(fā)酵過(guò)程中生成的氫和CO2作為主要的電子受體和供體通過(guò)還原反應(yīng)生成甲烷，在瘤胃功能性生態(tài)生境中發(fā)揮重要作用.除甲烷菌以外，其他瘤胃微生物也影響甲烷產(chǎn)量。瘤胃微生物總體來(lái)說(shuō)可分為產(chǎn)氫微生物和耗氫微生物兩大類。通過(guò)構(gòu)建克隆文庫(kù)等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，闡述氫代謝相關(guān)微生物數(shù)量和多樣性，并著重研究瘤胃內(nèi)與降低甲烷產(chǎn)生過(guò)程密切相關(guān)的耗氫微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，從微觀角度研究添加延胡索酸鹽對(duì)湖羊瘤胃氫代謝相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)的影響。

2、r>　　 第一部分延胡索酸二鈉添加對(duì)湖羊瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系總體變化趨勢(shì)的影響
　　 本部分通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)研究延胡索酸二鈉添加對(duì)湖羊瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系的研究。大量研究已證實(shí)茶皂素能夠減少瘤胃內(nèi)氫產(chǎn)生菌(原蟲(chóng))數(shù)量和活性，而延胡索酸鈉能提高瘤胃內(nèi)氫利用菌的數(shù)量和活性(延胡索酸還原菌)，推測(cè)兩者混合添加能從兩方面降低瘤胃內(nèi)氫壓，從而起到降低瘤胃甲烷產(chǎn)量的作用。通過(guò)體外茶皂素和延胡索酸二鈉的混合添加試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)茶皂素和延胡索酸鈉

3、混合添加時(shí)，對(duì)產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量和乙酸丙酸比有良好的互作效果。在此基礎(chǔ)上了進(jìn)行湖羊試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加延胡索酸二鈉30g/d連續(xù)飼喂6周，發(fā)現(xiàn)最后一周時(shí)丙酸顯著增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)延胡索酸二鈉添加顯著降低了甲烷菌(氫利用菌)數(shù)量、提高了主要纖維降解細(xì)菌(氫產(chǎn)生菌)R.albus和廷胡索酸還原菌F.succinogenes的數(shù)量，同時(shí)對(duì)真菌(氫產(chǎn)生菌)也有促進(jìn)作用。DGGE分析發(fā)現(xiàn)DGGE分析發(fā)現(xiàn)，隨著延胡索酸二鈉的添加細(xì)菌區(qū)系有從擬桿菌門變?yōu)楸?/p>

4、厚菌門的趨勢(shì)。
　　 第二部分添加延胡索酸二鈉對(duì)湖羊瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　 本部分取上述試驗(yàn)中的0周(對(duì)照組)和6周(處理組)的瘤胃液樣品構(gòu)建16S rRNA基因總菌文庫(kù)，探討了添加延胡索酸二鈉對(duì)湖羊瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組文庫(kù)共255個(gè)克隆中有73％的克隆屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)，24％的克隆屬于壁厚菌門(Firmicutes)。而延胡索酸處理組共231個(gè)克隆中有10％的克隆屬于壁

5、厚菌門，82％的克隆屬于擬桿菌門，還有4％的克隆屬于proteobacteria(蛋白分解菌門)，推測(cè)蛋白分解菌門在延胡索酸還原過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。對(duì)照組箘群(OTU)個(gè)數(shù)為75個(gè)，添加后增加為153個(gè)。兩個(gè)文庫(kù)合并分析共得到208個(gè)valid OTUs。兩個(gè)文庫(kù)的coverage值分別是79％和51％。說(shuō)明處理組還有很多新的菌群尚未發(fā)現(xiàn)。在處理組中還發(fā)現(xiàn)12個(gè)序列屬于Butyrivibrio(丁酸弧菌屬)，其中有3個(gè)克隆屬于Butyr

6、ivibrio fibrisolvens(溶纖維丁酸弧菌)，同源性為93％。還有8個(gè)序列屬于Butyrivibrio hungatei(亨氏丁酸弧菌)，相似性為99％。剩下9個(gè)屬于Butyrivibrio proteoclasticus，相似性為95％。而對(duì)照組中只發(fā)現(xiàn)2個(gè)序列屬于丁酸弧菌屬(id=95％)。可見(jiàn)延胡索酸添加促進(jìn)了丁酸弧菌屬的生長(zhǎng)。說(shuō)明這個(gè)屬的菌在延胡索酸代謝途中發(fā)揮著某種積極作用。作為纖維分解菌和丁酸生成菌Butyri

7、vibrio fibrisolvens的增加，表明添加延胡索酸鈉鹽后提高了纖維降解能力。另外還發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中有163個(gè)克隆屬于Prevotella屬的細(xì)菌，而處理組只有15個(gè)克隆與Prevotella相似，說(shuō)明隨著延胡索酸鈉鹽的添加Prevotella屬的細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)性大大降低，可能由其他與廷胡索酸代謝相關(guān)的菌代替成為優(yōu)勢(shì)菌群。另外處理組中27個(gè)克隆屬于Clostridium-like菌(id=86％)，而對(duì)照組只有6個(gè)克隆與Clostri

8、dium-like菌相似(相似性為86％)。與DOGE結(jié)果對(duì)應(yīng)，說(shuō)明Clostridium-like菌在廷胡索酸代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　 延胡索酸鈉添加顯著提高了瘤胃細(xì)菌的多樣性，并在各個(gè)分類水平上顯著改變了瘤胃細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)。
　　 第三部分添加延胡索酸二鈉對(duì)湖羊瘤胃甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　 本部分通過(guò)構(gòu)建對(duì)照組和添加延胡索酸鈉鹽組的瘤胃16S rRNA基因甲烷菌文庫(kù)，比較mcrA文庫(kù)和Archaeal

9、16S rRNA基因文庫(kù)反映瘤胃甲烷菌結(jié)構(gòu)的異同，從而結(jié)合兩種文庫(kù)探討添加延胡索酸二鈉是否對(duì)湖羊瘤胃甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mcrA文庫(kù)和Archaeal16S rRNA基因文庫(kù)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)結(jié)構(gòu)相似，說(shuō)明mcrA文庫(kù)可以在一定程度上替代Archaeal16S rRNA基因文庫(kù)來(lái)檢測(cè)瘤胃甲烷菌多樣性。兩個(gè)Archaeal16S rRNA基因文庫(kù)共有序列340個(gè)克?。浩渲袑?duì)照組158個(gè)，處理組182個(gè)。從rRNA進(jìn)化樹(shù)上，古菌界(A

10、rchaea)分為兩大門，泉古菌門(crenarchaeota)和廣古菌門(Euryarchaeota)。本研究檢測(cè)到湖羊瘤胃甲烷古菌都屬于廣古菌門(Euryarchaeota)、甲烷桿菌綱(Methanobactcria)。本研究基于97％相似度為臨界值，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組湖羊瘤胃Archaeal16S rRNA基因文庫(kù)可劃分為17個(gè)OTU，包括4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群(成員大于10個(gè))，第一個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群屬于Methanobrevibacter olley

11、ae，有46個(gè)克隆，同源性98％。第二優(yōu)勢(shì)菌群屬于Mbb.millerae，有37個(gè)成員，同源性為97％。第三個(gè)優(yōu)勢(shì)箘群為Mbb.ethanobrevibacter thaueri，有26個(gè)克隆，同源性為97％。第四優(yōu)勢(shì)菌群為Mbb.millerae，有24個(gè)成員，同源性97％。處理組則可分為6個(gè)OTU，共有2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群。第一優(yōu)勢(shì)菌群Mbb.millerae，有124個(gè)成員，相似性為98％。第二優(yōu)勢(shì)菌群為Mbb.Olleyae，有51個(gè)

12、克隆，相似性為98％。所以添加延胡索酸鈉降低了甲烷菌菌群的數(shù)量，由17個(gè)減少為6個(gè)。其中一個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群變得更加優(yōu)勢(shì)，成員顯著增加。
　　 Mbb.olleyae和Mbb.Millerae是湖羊瘤胃優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌。延胡索酸鈉鹽的添加在“種”的水平上改變了瘤胃甲烷菌群的結(jié)構(gòu)，菌群多樣性降低，但優(yōu)勢(shì)菌群變得更加集中，Mbb。Millerae數(shù)量顯著增加，發(fā)揮主要功能。
　　 第四部分延胡索酸鈉添加對(duì)其還原酶frda基因文庫(kù)多樣性的

13、影響
　　 本研究通過(guò)不同調(diào)控方式探討延胡索酸鈉對(duì)其其還原酶frdA基因文庫(kù)多樣性的影響。首先對(duì)上述動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)照組和處理組分別構(gòu)建Proteobacteria(變形菌門)延胡索酸還原酶基因fumarate reductase(frdA)克隆文庫(kù)，進(jìn)行frdA基因多樣性分析，共得到118個(gè)核苷酸序列，其中動(dòng)物對(duì)照組60個(gè)，處理組58個(gè)。經(jīng)mothur分析后，發(fā)現(xiàn)在unique水平動(dòng)物試驗(yàn)不添加延胡索酸鈉組共有37個(gè)OTU，處理組共

14、有38個(gè)OTU。發(fā)現(xiàn)湖羊瘤胃中的fumarate-reducing Proteobacteria主要有以下五大菌簇(clusters)：ClusterⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，分別屬于Proteus mirabilis，Vibrio furnissii，Shewanella sp.，Photobacterium sp.，和Mitsuokella multacida Sdh。添加延胡索酸二鈉組的菌群結(jié)構(gòu)較對(duì)照組發(fā)生顯著變化，對(duì)照組奇異變形菌(P

15、roteus mirabilis)占主導(dǎo)地位，添加廷胡索酸二鈉后弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)占主導(dǎo)地位。本研究中所有frdA序列在進(jìn)化樹(shù)中都與gammaproteobacteria在同一個(gè)分支，說(shuō)明所有序列都屬于gammaproteobacteria。富集試驗(yàn)中采用不同電子供體(甲酸或氫)，以延胡索酸二鈉為電子受體，進(jìn)行fumarate reducing Proteobacteria富集培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Proteus mira

16、bilis是與動(dòng)物試驗(yàn)文庫(kù)中共享的一個(gè)OTU(菌簇)。不同電子供體能顯著影響富集物中fumarate reducing Proteobacteria菌群結(jié)構(gòu)的變化。氫和甲酸為電子供體時(shí)，frdA文庫(kù)以Escherichia coil為主要優(yōu)勢(shì)菌群；氫為電子供體時(shí)，frdA文庫(kù)以Proteus mirabilis為主要優(yōu)勢(shì)菌群，而且此菌群和動(dòng)物試驗(yàn)frdA文庫(kù)是共享菌群。富集培養(yǎng)試驗(yàn)frdA文庫(kù)序列與已知菌相似性高，揭示出富集試驗(yàn)趨向于得

17、到相對(duì)較容易培養(yǎng)出來(lái)(relatively easy-to-culture)的菌種。還發(fā)現(xiàn)體內(nèi)富集文庫(kù)與已報(bào)道的牛瘤胃Bovine-rumen cluster的分支進(jìn)化距離很近，而只檢測(cè)到體外富集試驗(yàn)添加氫為電子供體文庫(kù)中的一個(gè)克隆(EH-OTU3)屬于Hu-sheeprumen cluster，其他所有的體外富集文庫(kù)與動(dòng)物文庫(kù)進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，從進(jìn)化樹(shù)的角度反映了體內(nèi)和體外富集廷胡索酸還原菌的差異。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)湖羊瘤胃中發(fā)現(xiàn)大量Vibri

18、o-relatedspecies。正常瘤胃條件下(0周)，發(fā)揮功能的主要fumarate-reducing Proteobacteria菌群屬于Proteus mirabilis。而添加延胡索酸6周后，主要功能菌群變?yōu)閂ibrio furnissii，Vibriofurnissii的優(yōu)勢(shì)程度從0周的18％增加到6周的50％。還發(fā)現(xiàn)6周時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)新的菌種：Shewanella sp.。然而Proteus mirabilis的優(yōu)勢(shì)程度從0