重組DEV gH與UL24基因桿狀病毒構建及gH與UL24蛋白細胞定位.pdf

1、本文對重組DEV gH與UL24基因桿狀病毒構建及gH與UL24蛋白細胞定位進行了研究。主要內容如下： 1.重組DEVgH與UL24基因桿狀病毒的構建：根據己發(fā)表的DEVgH與UL24基因序列，設計引物p1/p2、p3/p4與p5/p6并以DEV核酸為模板克隆gH(2505bp)與UL24(1230bp)基因。其中將gH基因分為互相重疊的兩個片段gH1與gH2，用引物p1/p2擴增gH1基因并將該基因連接pMD18-T載體構建克

2、隆載體pMD18-T-gH1；引物p3/p4擴增gH2基因。用Xho Ⅰ與SfcⅠ雙酶切pMD18-T-gH1，SfcⅠ與Kpn Ⅰ雙酶切gH2，最后將這兩段酶切產物與DBlueBacHis2A連接，成功構建了重組桿狀病毒轉移載體pBlue-gH。用p5/p6擴增UL24基因并將該基因連接pMD18-T載體構建克隆載體pMD18-T-UL24，用Xho Ⅰ與EcoR Ⅰ雙酶切DMD18-T-UL24，將酶切產物與pBlueBacHis2

3、A連接，構建重組桿狀病毒轉移載體DBlHe-UL24。分別將鑒定為陽性的重組質粒純化，與線性化的桿狀病毒共轉染Sf9昆蟲細胞，經3輪蝕斑篩選，獲得了純化的重組桿狀病毒。 2.gH蛋白細胞定位：將gH基因擴增產物連接pMD18-T構建克隆載體pMD18-T-gH，并與真核表達載體pcDNA3.1(+)分別用HindⅢ與EcoR Ⅰ雙酶切，構建重組真核表達載體pcDNA-gH。將純化的陽性重組質粒用脂質體法轉染293細胞，并用該純化

4、質粒免疫BALB/c鼠以制備抗gH蛋白血清。間接免疫熒光試驗表明，實現了DEVgH蛋白在體外的瞬時表達，并發(fā)現該蛋白定位于細胞外膜。將轉染細胞用Trizol法提取細胞總RNA，gH基因特異性引物進行RT-PCR檢測，結果出現目的條帶，進一步證明了gH蛋白在體外的表達。 3.UL24蛋白細胞定位：根據己發(fā)表的UL24基因序列，設計引物p7/p8以DEV核酸為模板進行擴增。將擴增后的目的基因亞克隆至pEGFP-C1載體中，構建重組表