利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)單體紅色熒光蛋白五指山小型豬研究.pdf

1、紅色熒光蛋白及其突變體能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)、蛋白和細(xì)胞熒光示蹤、研究蛋白質(zhì)之間相互作用。單體紅色熒光蛋白是一種能夠快速成熟的熒光蛋白，其激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，具有更高的組織滲透性，毒性低，比綠色熒光蛋白成熟速度快，抗干擾能力強(qiáng)。我們首次構(gòu)建pCX-mRFP1-pgk-neoR表達(dá)載體，探討單體紅色熒光蛋白做為報(bào)告蛋白在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因五指山小型豬有效性和安全性。
　　五指山小型豬，它具有體型小、性成熟早、遺傳穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)等特性，其血液生理

2、生化值和心、肝、腎對(duì)藥物代謝近似于人類；血型類似人類的O型血，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被廣泛研究。利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)具有新的遺傳性狀及抗病能力五指山小型豬是一種簡(jiǎn)單快速的方法，因此將外源基因?qū)牍┖思?xì)胞中顯得尤為重要。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍⑼庠椿?pCX-mRFP1-pgk-neoR導(dǎo)入到五指山小型豬耳成纖維細(xì)胞中，比較不同轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染方法對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，確定最佳的轉(zhuǎn)染時(shí)間、G418篩選濃度。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞形態(tài)觀察變化以及對(duì)

3、轉(zhuǎn)染前后染色體進(jìn)行核型分析，經(jīng)PCR法鑒定證實(shí)外源基因整合在細(xì)胞基因組中。同時(shí)利用體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建重構(gòu)胚，比較轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的卵裂率和囊胚率，最后生產(chǎn)轉(zhuǎn)單體紅色熒光蛋白五指山小型豬。
　　結(jié)果顯示:細(xì)胞匯合度為60％-80%，使用NucleofectorTM細(xì)胞核轉(zhuǎn)染技術(shù)，在U-023電轉(zhuǎn)程序下，能有效介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬耳成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率高達(dá)到83.33%。比采用FuGENE-HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率為65.00%和采用Li

4、pofectamine TM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率為9.70%均高，確定G418最佳篩選濃度為200μg/mL。經(jīng)核型分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)因細(xì)胞正常染色體率分別是80.5%（41/50）和92%(46/50)，無顯著差異。將外源基因pCX-mRFP1-pgk-neoR導(dǎo)入到五指山小型豬耳成纖維細(xì)胞中，利用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體生產(chǎn)的重構(gòu)胚卵裂率是83.08%(221/266)，囊胚率是11.65%(31/266)。確定以單體紅色熒光蛋白基

5、因?yàn)槟繕?biāo)基因，對(duì)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育無影響。將685個(gè)轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚移植到3頭代孕母豬體內(nèi)，2頭代孕母豬妊娠，其中一頭代孕母豬在妊娠38天時(shí)流產(chǎn)6頭胎兒，另一頭代孕母豬順利產(chǎn)出4頭克隆小型豬，通過PCR、原位熒光雜交、DNA雜交技術(shù)檢測(cè)證實(shí)所有后代均為轉(zhuǎn)基因后代。將一頭轉(zhuǎn)基因克隆五指山小型豬解刨后進(jìn)行組織學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)單體紅色熒光可以在五指山小型豬體內(nèi)廣泛表達(dá)，為器官移植、干細(xì)胞移植與分化研究提供一種標(biāo)記細(xì)胞、組織、器官來源，