銀杏外種皮多糖抑制新城疫病毒作用的研究.pdf

1、目的:為研究GBEP對(duì)NDV的作用，通過(guò)水提醇沉法提取銀杏外種皮多糖(GBEP)，采用苯酚-硫酸法測(cè)定GBEP的糖含量，并用傅里葉-紅外光譜法分析其光譜特征。在此基礎(chǔ)上將不同濃度GBEP接種DF-1細(xì)胞和9-11日齡雞胚，以測(cè)定GBEP在細(xì)胞和雞胚上的安全濃度。而后比較不同給藥方式（先給藥再加入病毒，先加入病毒再給藥以及藥物和病毒混合孵育后再攻毒）對(duì)NDV的作用。此外將NDV稀釋液加入到DF-1細(xì)胞中通過(guò)在不同時(shí)間段提取細(xì)胞和病毒的總R

2、NA，采用RT-PCR法定量分析NDV在不同時(shí)間段內(nèi)的mRNA表達(dá)量，以此解釋NDV侵染DF-1細(xì)胞的吸附、增殖和釋放特性;同時(shí)采用掃描電鏡觀(guān)察添加病毒后細(xì)胞表面的變化，以及采用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究NDV在細(xì)胞內(nèi)的增殖情況。最后將不同濃度(20、10、5μg/mL)的GBEP添加到細(xì)胞感染病毒的不同時(shí)間，采用RT-PCR法定量分析藥物作用后NDV的表達(dá)量，以及免疫熒光法探究藥物對(duì)NDV在DF-1細(xì)胞中復(fù)制特性的影響。
　　結(jié)果:G

3、BEP的糖含量為51.9％且不含淀粉;其紅外光譜圖呈典型的多糖圖譜，在1250.6cm-1有較強(qiáng)吸收。GBEP在不高于50μg/mL時(shí)對(duì)DF-1細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，不高于4 mg/枚雞胚時(shí)不影響雞胚的正常發(fā)育。抗NDV方面，在DF-1細(xì)胞上先給藥后加病毒組，1.25μg/mL GBEP組的OD值即顯著大于攻毒對(duì)照(P＜0.01)，與同劑量的利巴韋林組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）;先加病毒后給藥組，1.25μg/mL GBEP組的OD值

4、亦顯著大于攻毒對(duì)照組（P＜0.05），但不及同劑量的利巴韋林，但隨著劑量的增加其作用加強(qiáng);混合作用組GBEP的各濃度組的OD值均顯著大于攻毒對(duì)照組（P＜0.01）與同劑量的利巴韋林組相比無(wú)顯著差異(P＜0.05)。在雞胚中試驗(yàn)中，0.8 ng GBEP/枚組的胚體發(fā)育、HA血凝價(jià)均與利巴韋林組相近，而攻毒對(duì)照組雞胚在48 h時(shí)全部死亡。先攻毒再給GBEP組的雞胚在48 h時(shí)出現(xiàn)5枚死亡，60 h時(shí)全部死亡;先給藥再攻毒組中的雞胚在同時(shí)期

5、出現(xiàn)1枚死亡，而GBEP與病毒混合孵育后再攻毒組未出現(xiàn)死亡，且72h的胚體長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于攻毒對(duì)照組(P＜0.05）。
　　NDV在DF-1細(xì)胞上復(fù)制周期的檢測(cè)結(jié)果表明，NDV稀釋液加入到DF-1細(xì)胞后，約110min對(duì)細(xì)胞的吸附量達(dá)到飽和，同時(shí)在細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)有病毒粒子存在;病毒稀釋液添加到細(xì)胞約13h后其在細(xì)胞內(nèi)的增殖量達(dá)到最大，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng);病毒加入到細(xì)胞6h時(shí)，細(xì)胞上清液中即可檢測(cè)到NDV，42h時(shí)NDV含量達(dá)到最大，

6、說(shuō)明病毒感染6h后即開(kāi)始釋放。不同濃度的GBEP和NDV同時(shí)加入到細(xì)胞后，NDV對(duì)DF-1細(xì)胞的吸附量極顯著低于攻毒對(duì)照組（P＜0.01）;在病毒進(jìn)入細(xì)胞后再加入不同濃度的GBEP也可極顯著降低NDV在細(xì)胞內(nèi)的增殖量(P＜0.01);此外藥物和病毒共同孵育后再加入細(xì)胞，NDV對(duì)細(xì)胞的吸附量也極顯著低于攻毒對(duì)照組(P＜0.01);RT-PCR結(jié)果顯示，各加藥組的NDV-F基因的表達(dá)量都低于攻毒對(duì)照組;免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，各藥物組的熒光強(qiáng)