外泌體攜帶microRNAs促進(jìn)新城疫病毒復(fù)制.pdf

1、外泌體(exosome，Exo)是一類由細(xì)胞主動(dòng)分泌釋放到胞外的小囊泡，直徑大小約在30-150nm。它憑借自身能在細(xì)胞間傳遞蛋白，核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)，脂類等生物活性物質(zhì)而在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，已有相當(dāng)多關(guān)于外泌體與病毒感染的研究報(bào)道，尤其是外泌體在人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)和丙型肝炎病毒(the Hepatitis C viru

2、s，HCV)感染中生物功能的研究。然而，目前仍未有關(guān)于外泌體在新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染中的相關(guān)報(bào)道。
　　MicroRNA(miRNA)，作為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)家族成員之一，通過mRNA剪切和抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式負(fù)調(diào)控靶基因，參與多個(gè)生理和病理過程。在病毒感染中，已發(fā)現(xiàn)多種microRNA也能調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，然而與NDV感染相關(guān)的microRNA

3、仍鮮有報(bào)道。
　　得到高質(zhì)量的外泌體樣品是外泌體與NDV感染研究進(jìn)行的第一步。為此，我們利用差速離心法分離，并通過透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy，TEM)，納米顆粒捕捉技術(shù)(Nanosight Tracking Analysis,NTA)，蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting，WB)等不同方法鑒定出可靠有效的HeLa細(xì)胞分泌的外泌體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)將NDV感染的HeLa細(xì)胞外

4、泌體純化后孵育DF-1細(xì)胞，與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出明顯細(xì)胞病變，暗示該外泌體能增強(qiáng)NDV感染HeLa細(xì)胞。
　　采用Microarray芯片技術(shù)檢測(cè)新城疫感染組與未感染組的HeLa細(xì)胞外泌體內(nèi)miRNA表達(dá)譜差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)236個(gè)宿主miRNA發(fā)生了兩倍以上的表達(dá)差異，其中145個(gè)miRNA呈現(xiàn)顯著上調(diào)。經(jīng)過生物信息學(xué)軟件初步預(yù)測(cè)篩選出25個(gè)可能靶向β干擾素(interferon-β，IFN-β)分子的miRNA，后經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)

5、證發(fā)現(xiàn)當(dāng)用poly(I∶C)處理或NDV感染HeLa細(xì)胞，分別過表達(dá)這25個(gè)miRNA，過表達(dá)其中3個(gè)miRNA(miR-1273f,miR-1184，miR-198)時(shí)，IFN-βmRNA和蛋白水平都呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。
　　熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)miRNA minics與含IFN-β3'UTR熒光載體共轉(zhuǎn)染H293T細(xì)胞時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著下降，暗示這三個(gè)miRNA可能直接靶向IFN-β3'UTR。后期發(fā)現(xiàn)這三個(gè)miRNA不僅能

6、影響干擾素刺激基因(IFN stimulated genes，ISGs)的轉(zhuǎn)錄如干擾素刺激基因15（Interferon-stimulated gene15，ISG15），干擾素刺激基因56(Interferon-stimulated gene56，ISG56)，抗粘病毒抗性蛋白(antiviral myxovirus resistance protein1，Mx1)，寡腺苷酸合成酶1(theoligoadenylate synthet

7、ase1，OAS1)，還能增強(qiáng)NDV NP mRNA轉(zhuǎn)錄與NP蛋白翻譯，此外模擬外泌體攜帶這些miRNA的過程中發(fā)現(xiàn)，攜帶有miRNA的外泌體在NDV感染中能增強(qiáng)噬斑在DF-1細(xì)胞上形成，暗示其能促進(jìn)NDV擴(kuò)散。
　　綜上，我們以NDV感染HeLa細(xì)胞，經(jīng)系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三個(gè)通過直接靶向IFN-β影響NDV復(fù)制的miRNAs(miR-1273f,miR-1184，miR-198)，我們首次驗(yàn)證了外泌體能促進(jìn)NDV感染HeLa細(xì)胞，并通