牛副結(jié)核病多重組抗原間接ELISA方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、為了建立一種有效的牛副結(jié)核病間接ELISA方法，本研究設(shè)計(jì)了兩對引物，從副結(jié)核分枝桿菌P<,18>株的基因組中PCR擴(kuò)增出兩個(gè)目的基因map0862和map2154c、，采用重疊延伸剪接技術(shù)(splice by overlapping extension，SOE)獲得融合基因map0862-2154c。經(jīng)過多次亞克隆步驟后，將DNA片段map0862-2154c串連于表達(dá)載體pET32a(+)中，獲得了重組質(zhì)粒pET0862-2154c

2、。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)大腸桿菌感受態(tài)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，以Ni<'2+>鰲合層析的方法純化融合蛋白。Western blot分析表明重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)活性。 以融合蛋白作為包被抗原，在確定了最佳封閉液和最佳包被條件后，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀釋度，以及最佳一抗、二抗作用時(shí)間和顯色時(shí)間，建立了檢測牛副結(jié)核病抗體的間接EIASA方法。用95份健康牛血清的檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析后確定診斷

3、方法的判定標(biāo)準(zhǔn)，即牛血清樣本(mbp0862-2154c) S/P大于0.42為陽性，小于0.34為陰性，兩者之間為可疑。 通過對90份牛副結(jié)核病血清和100份無副結(jié)核病牛血清的檢測結(jié)果表明，ELISA方法的敏感性為84.44％(76/90)，特異性為97％(97/100)。用確定的間接ELISA方法對50份副結(jié)核陰性血清(副結(jié)核病試劑盒檢測)和54份副結(jié)核陽性血清(副結(jié)核病試劑盒檢測)共104份檢測，檢測結(jié)果進(jìn)行比較，本方法與