水稻呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法研究.pdf

1、隨著代謝組學(xué)的興起,人們越來越關(guān)注和重視對低分子量代謝產(chǎn)物的分析。已有研究表明,作為遺傳信息終產(chǎn)物的低分子量代謝產(chǎn)物,尤其是一些極性代謝產(chǎn)物在生物體內(nèi)起到關(guān)鍵作用。呼吸在植物體的整個代謝網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐地位,其代謝途徑多樣,具體過程十分復(fù)雜。呼吸作用主要包括糖酵解、戊糖磷酸途徑和三羧酸循環(huán),代謝產(chǎn)物如磷酸糖、有機酸、腺苷、還原型輔酶等化合物在植物體內(nèi)具有重要的生理作用,通過分析相關(guān)代謝產(chǎn)物可以更加全面認識植物呼吸。
　　 呼吸相關(guān)

2、代謝產(chǎn)物極性強、親水性強、化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,不能被反相色譜柱保留。目前,常采用的方法有陰離子交換色譜法、反相離子對色譜法等,盡管這些方法在一定程度上也能夠取得良好的分離效果,但這些分離模式與質(zhì)譜檢測器(MS)的兼容性差,且受靈敏度低等因素的限制。此外,現(xiàn)有的方法能檢測的樣品基質(zhì)多為細菌、酵母、培養(yǎng)細胞等簡單基質(zhì),對復(fù)雜生物系統(tǒng)如植物研究的較少；且大多只能檢測樣品中幾種或某一類化合物,缺乏針對復(fù)雜基質(zhì)條件下呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的比較全面、有效的檢

3、測方法。
　　 親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography,HILIC),是一種用來改善在反相色譜中保留較差的強極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù),且與質(zhì)譜的兼容性好。本論文采用新型親水作用色譜技術(shù)(HILIC),以聚合氨基柱Shodex Asahipak NH2P-504E為固定相,結(jié)合高靈敏、高選擇性的串聯(lián)質(zhì)譜檢測器,建立了一種高通量的HILIC-MS／MS分析方法,可對水稻中的29種

4、呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物同時進行準確定性定量分析。通過本實驗方法的建立,取得了如下主要研究成果:
　　 1.確定了最佳質(zhì)譜條件
　　 通過一級質(zhì)譜全掃描,得到每個目標代謝物的準分子離子峰,并分別比較各目標物在正離子掃描與負離子掃描兩種掃描模式下,準分子離子峰的響應(yīng)強度,確定了羧酸類、磷酸糖、及AMP、ADP、ATP、cGMP、GTP等腺苷類化合物選擇負離子模式監(jiān)測,而NAD+、NADH、NADP、NADPH、FAD、乙酰輔酶A、

5、琥珀酰輔酶A等化合物選擇正離子模式監(jiān)測；再進行二級質(zhì)譜掃描得出每個目標代謝物的特征子離子,并在選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)下進行準確定性定量分析。
　　 2.選擇了適用于呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的色譜柱
　　 通過對兩性鍵合固定相ZIC-HILIC色譜柱與聚合氨基色譜柱Shodex Asahipak NH2P-504E的比較研究,明確了目標代謝物質(zhì)在聚合氨基液相色譜柱上具有更好的保留行為,分離效果更好。
　　 3.明確了p

6、H、緩沖鹽的種類及濃度等色譜條件對目標代謝物分離的影響
　　 通過流動相pH與緩沖鹽試驗,發(fā)現(xiàn)pH值與緩沖鹽是影響目標化合物保留的兩個至關(guān)重要的因素。其表現(xiàn)的具體規(guī)律是:隨著pH值與緩沖鹽濃度的增大,流動相洗脫能力增強,出峰的化合物個數(shù)增加,靈敏度提高,峰形改善；0～20mM范圍的甲酸銨、乙酸銨,均無法解決檸檬酸與異檸檬酸的拖尾以及含多個磷酸根化合物難洗脫的問題,15mM的碳酸銨或碳酸氫銨可確保所有目標化合物出峰,并成功解決了拖

7、尾、吸附難題；碳酸銨與碳酸氫銨的作用無明顯差異；緩沖鹽濃度與pH的最佳組合為碳酸銨濃度15mM,pH10.3。
　　 4.確定了提取水稻樣品中呼吸代謝產(chǎn)物的最佳條件
　　 在水稻樣品的提取中,考察了沸水、80％乙腈、(750:200:50,v／v／v)乙腈／水／甲酸、(3:7,v／v)氯仿／乙腈+水等不同提取液的提取效率。結(jié)果表明,(3:7,v／v)氯仿／乙腈+水的提取最好:在選擇提取方式時,考察了超聲提取和振蕩提取對提

8、取效率的影響,得出振蕩提取方法更為有效。
　　 5.建立了水稻樣品中呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的測定方法
　　 確定了標準曲線和線性范圍、檢測限、加標回收率和精密度等方法學(xué)參數(shù)。29種呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物在0.01～10mg／kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,方法的檢測限分別為0.001～0.25mg／kg；相對標準偏差(RSD)小于20％,加標回收率為63.3～133.5％。
　　 6.用已建立的提取方法