液相串聯(lián)質(zhì)譜測定水稻37種內(nèi)源激素方法的研究.pdf

1、植物激素是植物體內(nèi)合成的一系列痕量有機化合物,其對植物生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。植物內(nèi)源激素對植物體生長發(fā)育任一生理過程的調(diào)節(jié),都不是單一激素作用的結(jié)果,而是多種激素之間相互作用的結(jié)果。因此,開展生理水平的多種內(nèi)源激素檢測及相關(guān)的前處理技術(shù)平臺的研究是探索植物激素生理作用的基礎(chǔ)工作。
　　 水稻基質(zhì)的復雜性以及待測物的痕量、動態(tài)不僅給內(nèi)源激素分析帶來了困難,同時基質(zhì)共萃取物會引起基質(zhì)效應,所以如何將內(nèi)源激素從水稻中高效分離凈化

2、是內(nèi)源激素測定的關(guān)鍵。本文基于混合模式固相萃取凈化技術(shù),篩選80％甲醇水溶液等有機溶劑提取水稻中內(nèi)源激素,優(yōu)化混合模式固相萃取凈化條件。通過對提取、分離和凈化條件的摸索,結(jié)合固相萃取技術(shù)建立了液相色譜-質(zhì)譜法對水稻中37種內(nèi)源激素的檢測方法,并評價檢測中的基質(zhì)效應。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.研究并建立了37種內(nèi)源激素的HPLC-MS／MS分析方法。主要研究了有機酸種類、柱溫和梯度陡度等影響色譜分離中容量因子(k)、分離

3、度(R)的重要因素,以解決同分異構(gòu)體的色譜分離。研究表明當水相中不添加任何有機酸,即水相為5mM甲酸銨時,細胞分裂素葡萄糖結(jié)合物(Z7G-Z9G-ZOG、DZ7G-DZ9G-DZOG)可以達到基線分離,分離度大于2；而梯度陡度較柱溫對赤霉素同系物(GA1-GA3、GA4-GA7、GA9-GA53)色譜分離影響較明顯,分離度近似變化了50％-130％。而當柱溫為40℃、梯度陡度為4％／min能基本保證赤霉素同系物的色譜分離,而GA1-GA

4、3分離度仍舊小于0.5:同時還研究了流動相組成、質(zhì)譜條件對方法靈敏度的影響。研究表明甲醇-甲酸銨(5mM)流動相體系在Dynamic MRM采集模式下不僅能保證正離子模式下同分異構(gòu)體的分離,同時具有較好的質(zhì)譜響應值,靈敏度可以提高5-10倍；而利用建立的檢測方法對37種內(nèi)源激素進行5μg／l、25μg／l、50μg／l3個水平的加標回收實驗(n=3),其平均回收率范圍為61％-109％之間,相對標準偏差小于16％；37種內(nèi)源激素的方法檢

5、出限(S／N=3)為0.0005μg／l-25μg／l。
　　 2.建立了以80％甲醇水溶液為提取溶劑、混合模式固相萃取凈化為水稻中內(nèi)源激素核心技術(shù)的前處理方法。對提取溶劑、浸提時間、固相萃取柱上樣液的組成和洗脫劑的組成等影響內(nèi)源激素提取效率、分離凈化的重要因素進行了研究。研究表明采用80％甲醇水溶液作為提取溶劑,提取后浸提12h得到Z9G的提取量,是直接上機測定的2倍；采用稀釋提取液使甲醇的體積分數(shù)為33％可保證混合陰離子、混

6、合陽離子交換反相固相萃取柱對內(nèi)源激素的最大滯留。該方法操作簡單、省時,并簡化了常規(guī)做法的濃縮步驟。
　　 3.評價了檢測中的基質(zhì)效應,并采用建立的混合模式固相萃取柱對水稻基質(zhì)進行凈化以考察對基質(zhì)效應的消除作用。研究表明基質(zhì)效應主要取決于化合物性質(zhì)、不同基質(zhì)介質(zhì)和不同的添標水平。不同的化合物在不同基質(zhì)介質(zhì)中均具有不同程度的基質(zhì)效應,且隨濃度的降低基質(zhì)效應越大,特別是赤霉素、生長素和脫落酸。而通過混合模式固相萃取凈化可以減少引起基質(zhì)