棉花GhDUF231L1基因的克隆與功能研究.pdf

1、棉花（Gossypium hirsutum）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，改良棉花纖維品質(zhì)具有十分重要的意義。在棉花培育中，單純利用傳統(tǒng)育種方法提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)很難取得預(yù)期成效，而利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)改善棉花品質(zhì)，提高棉花產(chǎn)量，是一條行之有效的途徑。DUF231家族是一類具有未知功能結(jié)構(gòu)域的蛋白，目前對(duì)該家族的研究?jī)H有極少報(bào)道，在擬南芥中，該類蛋白參與細(xì)胞壁組分中的果膠生物合成，并影響半纖維素及纖維素的含量。本文分離克隆了一個(gè)新的棉花基因，命

2、名為GhDUF231L1，并對(duì)該基因的表達(dá)和功能進(jìn)行了初步研究，取得如下研究結(jié)果:
　　1、GhD UF231L1基因克隆鑒定
　　我們?cè)诿藁ㄖ锌寺×薌hDUF231L1基因及全長(zhǎng)cDNA序列。序列分析表明，GhDUF231L1基因含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，開放閱讀框(ORF)為1293 bp，編碼一個(gè)含有430個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步的蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，GhDUF231L1的N端含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，C端是一個(gè)功能未知的結(jié)

3、構(gòu)域。
　　2、GhDUF231 L1在棉花組織中的表達(dá)分析
　　利用RT-PCR技術(shù)分析了GhDUF231L1在棉花組織中的表達(dá)譜。結(jié)果顯示，GhDUF231L1在棉花纖維中特異表達(dá)，在棉纖維細(xì)胞次生壁增厚期(15-20 DPA)達(dá)到表達(dá)高峰，暗示著GhDUF231L1可能在棉纖維細(xì)胞次生壁發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
　　3、GhDUF231 L1啟動(dòng)子活性分析
　　分離克隆了GhDUF231L1基因的啟動(dòng)子片段。為

4、研究GhDUF231L1基因的啟動(dòng)子表達(dá)活性，構(gòu)建了該啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因的融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。GUS活性染色分析顯示，GhDUF231L1啟動(dòng)子主要是在轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座葉葉脈、根和莖維管組織以及花和莢果的一些組織中具有表達(dá)活性。
　　我們截取了不同長(zhǎng)度GhDUF231L1啟動(dòng)子序列，將這些序列分別與GUS基因連接，構(gòu)建了多個(gè)不同啟動(dòng)子長(zhǎng)度的表達(dá)載體之后，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。待植株生長(zhǎng)六周后，

5、選取蓮座葉以上10cm處的莖，進(jìn)行橫切并GUS染色分析。結(jié)果表明，GhDUF231L1啟動(dòng)子全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)部細(xì)胞中有強(qiáng)的GUS信號(hào);在缺失SNBE1元件的GhDUF231L1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，信號(hào)出現(xiàn)在皮層和木質(zhì)部導(dǎo)管中;在缺失SNBE2的GhDUF231L1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，信號(hào)出現(xiàn)在皮層和韌皮部中;在缺失了SNBE1/2的GhD UF231L1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，信號(hào)出現(xiàn)在皮層和韌皮部，但是GUS信號(hào)要更強(qiáng)一些

6、。上述結(jié)果表明，SNBE元件對(duì)于GhDUF231L1啟動(dòng)子的組織特異表達(dá)活性具有重要的作用。
　　4、GhDUF231L1蛋白亞細(xì)胞定位
　　運(yùn)用TMHMM分析軟件，預(yù)測(cè)GhDUF231L1可能是一個(gè)膜定位蛋白。于是，本文構(gòu)建了GhDUF231L1-eGFP的融合載體，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行煙草葉片轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。48小時(shí)暗培養(yǎng)后，在共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示GFP綠色熒光分布在煙草細(xì)胞周邊區(qū)域，這說明GhDUF231L1蛋白

7、定位在細(xì)胞膜上。
　　5、GhDUF231L1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析
　　為研究GhDUF231L1基因的功能，我們從Wolf-Rudiger Scheible教授實(shí)驗(yàn)室獲得tbl3突變體。對(duì)tbl3突變體進(jìn)行檢測(cè)分析，顯示這些tbl3突變體種子都是純合體。tbl3突變體植株纖維素含量顯著的低于野生型且tbl3葉片呈不規(guī)則扭曲。葉柄的石蠟切片結(jié)果顯示tbl3葉柄中的維管束呈現(xiàn)出不規(guī)則排列，這可能是造成葉片扭曲的原因。<

8、br>　　構(gòu)建了GhDUF231L1過量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。通過比較6周齡(6-week-old)野生型、GhDUF231L1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和tbl3突變體的生長(zhǎng)高度，發(fā)現(xiàn)GhDUF231L1過量表達(dá)擬南芥植株最高，野生型次之，而tbl3突變體最矮。同時(shí)，分別測(cè)定了它們的纖維素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GhDUF231L1過量表達(dá)擬南芥含量最高，野生型次之，tbl3最低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明GhDUF231L1過量表達(dá)可以提