抗狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立.pdf

1、狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的一種人獸共患傳染病,一旦發(fā)病,死亡率幾乎為100％。狂犬病呈全球性分布,每年大概有5.5萬(wàn)人死于該疾病。盡管在控制狂犬病方面做了很多努力,但在發(fā)展中國(guó)家,犬貓患病仍然是一個(gè)極為嚴(yán)重的問(wèn)題。對(duì)犬貓接種狂犬疫苗后免疫效果的評(píng)價(jià)以及對(duì)狂犬病病原的診斷是防止和控制狂犬病的關(guān)鍵。鑒于以上現(xiàn)實(shí)考慮,本研究利用基因工程技術(shù)以及免疫學(xué)技術(shù)建立了狂犬病病毒抗體和抗原的檢測(cè)方法,為

2、狂犬病的防制工作的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。
　　 用RT-PCR方法分別擴(kuò)增山狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N(xiāo)1區(qū)域(1000-1353 bp),將二者分別克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中,并將重組的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)1mmol／L IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明,重組的RV-N和RV-N1均以包涵體形式表達(dá)。與表達(dá)全長(zhǎng)RV-N相比,RV-N1的表達(dá)量顯著高于前者,且該重組蛋白同

3、樣具有良好的反應(yīng)原性。用純化的重組RV-N1作為診斷抗原建立了檢測(cè)犬RV抗體的SPA-ELISA方法。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,確定抗原最佳包被量是2μg／mL,血清的最佳稀釋度為1:100,ProteinA-HRP的稀釋度為1:4000。用建立的ELISA方法對(duì)102份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè),與商品化試劑盒相比,二者的符合率為94.1％。試驗(yàn)結(jié)果表明基于主要抗原表位所在區(qū)域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗體水平的檢測(cè),為檢測(cè)R

4、V免疫抗體的ELISA試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　 將純化后的pET-32a-RV-N蛋白免疫BALB／c小鼠,取小鼠脾臟細(xì)胞和SP2／0細(xì)胞融合后,用pGEX-6P-1-RV-N重組蛋白作為篩選抗原,經(jīng)三次亞克隆篩選后得到1D9、286、3C5、685及5F2五株單克隆抗體細(xì)胞株。亞類(lèi)鑒定結(jié)果表明,其中1D9、286、685三株亞類(lèi)為IgG1型,3C5、5F2的亞類(lèi)為IgM型。間接ELISA方法檢測(cè)286單抗細(xì)胞腹水效價(jià)可達(dá)

5、1:106。經(jīng)Protein G親和層析柱純化和脫鹽后可得到濃度為2.5 mg／mL的高純度的單克隆抗體。免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明五株單克隆抗體均能特異地與狂犬病病毒結(jié)合。
　　 用純化后的pET-32a-RV-N蛋白免疫新西蘭白兔,將收集的兔高免血清用Protein A親和層析柱純化后得到高純度的抗狂犬病病毒N蛋白的多克隆抗體。間接ELISA測(cè)定多抗的效價(jià)可達(dá)1:2×105。用生物素標(biāo)記多抗后,建立了一種“抗RV-N蛋白單抗—病原