頭孢氨芐單克隆抗體的研制及免疫學(xué)檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、頭孢氨芐(Cephalexin，CEX)屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactam antibiotics)，開(kāi)發(fā)距今已五十載，由于其抗菌譜廣、吸收效果好、價(jià)格低廉，在人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上一直有很廣泛的應(yīng)用。但是，在細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重的今天，頭孢氨芐等抗生素殘留問(wèn)題必須得到重視。目前，中國(guó)、美國(guó)、英國(guó)、歐盟等多個(gè)國(guó)家或組織都已對(duì)頭孢氨芐最大殘留限量做出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。
　　檢測(cè)分析手段的提高是應(yīng)對(duì)抗生素殘留必不可少的關(guān)鍵。檢測(cè)頭孢氨芐殘留

2、的方法主要有微生物檢測(cè)法（包括TTC法、擴(kuò)散法等）、儀器檢測(cè)法（包括UV-Vis、HPLC、LC-MS等）和免疫學(xué)檢測(cè)法（包括ELISA、FPIA、IC等）。微生物法特異性不強(qiáng)、靈敏度不高，而且易受到其他條件干擾，已無(wú)法滿足當(dāng)前實(shí)際工作中快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求;儀器分析法靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，但昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器、復(fù)雜的前處理過(guò)程、操作繁瑣的方法步驟是制約該法廣泛應(yīng)用的重要因素;免疫學(xué)檢測(cè)法特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少，但假陽(yáng)

3、（陰）性率高、重復(fù)性較差卻是這種方法的局限性。目前來(lái)看，將免疫學(xué)方法與儀器檢測(cè)法聯(lián)合使用是一種科學(xué)、合理、高效的檢測(cè)分析思路。將免疫學(xué)方法作為前期工作初篩方法，儀器分析法作為后期確證方法，這不僅可大規(guī)模快速篩選，而且也能保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
　　本研究旨在制備出親和力高、特異性強(qiáng)的抗頭孢氨芐單克隆抗體，以期建立快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的免疫學(xué)檢測(cè)方法，為我國(guó)頭孢氨芐在動(dòng)物性食品中殘留監(jiān)控提供理論和技術(shù)支持。研究包括以下四點(diǎn)內(nèi)容:

4、　　1、頭孢氨芐人工抗原的合成與鑒定。利用偶聯(lián)劑戊二醛將頭孢氨芐與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)，分別制備免疫抗原CEX-BSA和包被抗原CEX-OVA。經(jīng)紫外分光光度法、SDS-PAGE凝膠電泳和免疫學(xué)方法，鑒定人工抗原的合成是成功的。
　　2、抗頭孢氨芐單克隆抗體的制備與鑒定。利用單克隆抗體技術(shù)，將受免小鼠B淋巴細(xì)胞與SP2/0融合，通過(guò)有限稀釋法和CiELISA篩選得到2株單克隆細(xì)胞株(2B4、5B3)，并將其注入小鼠腹腔，

5、得到腹水型單克隆抗體。經(jīng)Protein G HP親和層析柱純化后鑒定，2G4單克隆抗體效價(jià)高于1∶1.28×105，其抗體亞型為IgG2b（κ輕鏈），抗體親和力常數(shù)為K=1.51×109 L/mol，抗體除了與頭孢拉定有52.55％的交叉反應(yīng)率，與頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、青霉素、鏈霉素、四環(huán)素等藥物均無(wú)明顯交叉反應(yīng)，說(shuō)明制備的抗體親和力高、特異性較好，為后續(xù)免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立打下了良好的基礎(chǔ)。
　　3、鮮奶中頭孢

6、氨芐ELISA檢測(cè)方法的建立。本章研究中排除了鮮奶基質(zhì)干擾影響，并優(yōu)化了封閉液的成分和濃度，摸索了2G4單克隆抗體與包被抗原CEX-OVA的最佳工作濃度，所繪制的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線線性關(guān)系良好R2=0.9909，在20～1000 ng/mL藥物濃度范圍里，線性方程為y=0.4674x-0.5359，IC50為163.55 ng/mL，LOD為19.68 ng/mL。通過(guò)對(duì)樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法檢測(cè)靈敏度較高，樣品回收率在83.98％～

7、102.92％之間，平均回收率為91.31％;變異系數(shù)在8.50％～14.5％之間，平均變異系數(shù)為10.75％，符合我國(guó)規(guī)定的頭孢氨芐在牛奶中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，具有一定應(yīng)用價(jià)值。
　　4、頭孢氨芐膠體金免疫層析試紙條的研制。采用檸檬酸三鈉還原法制備不同粒徑膠體金，摸索制備金標(biāo)抗體的最佳pH和最適單抗標(biāo)記量，摸索金標(biāo)墊中金標(biāo)抗體結(jié)合量，優(yōu)化NC膜中C線（羊抗鼠IgG）與T線(CEX-OVA)噴涂量，優(yōu)化了NC膜封閉液成分，并對(duì)試紙條

8、穩(wěn)定性、靈敏度、特異性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示:金標(biāo)抗體最佳pH為8.4，最佳單抗標(biāo)記量為每200μL膠體金溶液中加入9μL單抗;金標(biāo)墊中金標(biāo)抗體以稀釋1.5倍，30μL/cm噴量效果最佳;NC膜C線、T線的最佳噴量分別為0.8μL/cm、0.6μL/cm;封閉液選擇3％BSA的0.01 mol/L PB緩沖液比較合適;經(jīng)鑒定該試紙條檢測(cè)限為500 ng/mL，除了與頭孢拉定有輕微交叉反應(yīng)，與頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、青霉素、鏈