IBDV VP1單克隆抗體的制備和穩(wěn)定表達Vero E6細胞系的建立.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一，其病毒(Infeetious bursal disease virus，IBDV)主要侵害雛雞的中樞免疫器官法氏囊，導致免疫抑制。VP1是一種依賴RNA的RNA聚合酶，與IBDV的復(fù)制效率和毒力的關(guān)系日趨成為研究IBDV的熱點。筆者現(xiàn)有資料，國內(nèi)關(guān)于IBDV VP1的表達、單克隆抗體的制備和穩(wěn)定表達’VP1細胞系的建立尚未見報道

2、。 本研究的目的之一是構(gòu)建IBDV VP1基因的原核表達載體，以原核表達的VP1蛋白為免疫原制備特異性單克隆抗體，制備的單克隆抗體可以為下一步建立細胞系提供檢測的物質(zhì)條件；目的之二構(gòu)建IBDV VP1基因的真核表達載體，建立穩(wěn)定表達VP1蛋白的Vero E6細胞系，為深入研究VP1與病毒復(fù)制和毒力的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 本課題主要研究內(nèi)容包括以下幾方面： 1．IBDV VP1的原核表達及其多克隆抗體的制備從已構(gòu)建含有I

3、BDV Gt株B節(jié)段的質(zhì)粒中擴增出VP1基因，將其克隆到表達載體pET32a。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E．coli DH5α，獲得重組陽性質(zhì)粒pET32α-VP1。將pET32α-VP1轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，在IPTG誘導下成功表達了約115 ku的VP1融合蛋白，并以包涵體形式存在。用電泳法純化蛋白并免疫：BALB/c小鼠，制備了多克隆抗體。Western blot分析表明，純化的蛋白能夠被抗His單克隆抗體和IBDV陽性血清識別。EL

4、ISA分析表明，制備的融合蛋白抗血清效價在1：12800以上。間接免疫試驗表明，多克隆抗體能與自然結(jié)構(gòu)的IBDV發(fā)生特異性反應(yīng)。 2．IBDV VP1單克隆抗體的制備與鑒定取上面免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞常規(guī)融合，依次進行HAT選擇培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽性克隆，有限稀釋法進行單克隆化。獲得了C4、D4兩株能穩(wěn)定分泌抗IBDVVP1的雜交瘤細胞株，并對C4、D4進行了穩(wěn)定性、特異性方面的鑒定。腹水的效價分別為1×

5、10<'5>和1×10<'2>，IgG亞類鑒定均為。IgGl。 3．穩(wěn)定表達IBDV VP1的Vero E6細胞系的建立將IBDV Gt株的VPl基因分別克隆到真核表達載體pCI-neo和pEGFP-N1，獲得真核表達質(zhì)粒pCI-neo/VP1和pEGFP-N1/VP1。在脂質(zhì)體介導下，將其導入Vero E6細胞，進行瞬時表達分析。經(jīng)G418篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，用有限稀釋法獲取亞克隆細胞株。然后通過間接免疫熒光和RT-PC