馬鈴薯甲蟲脯氨酸脫氫酶基因的克隆、表達分析及其dsRNA的發(fā)酵生產(chǎn).pdf

1、脯氨酸脫氫酶在昆蟲中廣泛存在，其功能是氧化脯氨酸生成丙氨酸、二氧化碳和水。許多研究表明，脯氨酸脫氫酶主要參與了昆蟲重要神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的合成。但脯氨酸脫氫酶的另一功能--為鞘翅目昆蟲的長距離飛行提供直接能量--一直沒有受到應(yīng)有的重視。本論文主要研究了重要鞘翅目害蟲馬鈴薯甲蟲的脯氨酸脫氫酶基因，解析馬鈴薯甲蟲脯氨酸脫氫酶的基因結(jié)構(gòu)，檢測脯氨酸脫氫酶基因在馬鈴薯甲蟲越冬前后表達豐度的差異，并在得到馬鈴薯甲蟲脯氨酸脫氫

2、酶基因干擾載體的基礎(chǔ)上利用微生物發(fā)酵技術(shù)大量獲得其dsRNA。本項研究對于更好的理解鞘翅目昆蟲的長距離飛行及馬鈴薯甲蟲的防治，具有重要意義。
　　 一、馬鈴薯甲蟲脯氨酸脫氫酶基因全長的克隆
　　 根據(jù)其他昆蟲的脯氨酸脫氫酶基因保守域序列設(shè)計兼并引物，擴增出馬鈴薯甲蟲脯氨酸脫氫酶基因的中心區(qū)段，結(jié)合5’RACE和3’RACE技術(shù)獲得該基因的1個5’端序列和3個3’端序列，經(jīng)序列拼接獲得3個長度分別為2509bp、3076b

3、p、3231bp的脯氨酸脫氫酶可變剪接體，在GenBank中登錄號分別為GU355892、GU355893、GU355894，依次定名為脯氨酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄異型體-1、2與3。序列分析結(jié)果表明，這3個可變剪接體均包含1個的開放閱讀框，編碼616氨基酸，其理論上的等電點PI=8.87，相對分子質(zhì)量為7.07×104，聚類分析顯示其與已報道的其它昆蟲的脯氨酸脫氫酶基因具有較高的氨基酸序列同源性。
　　 二、馬鈴薯甲蟲脯氨酸脫氫酶基因

4、的表達分析
　　 經(jīng)過end-to-end PCR驗證，進一步證實了馬鈴薯甲蟲脯氨酸脫氫酶的3個轉(zhuǎn)錄異型體是確實存在的。以基因組DNA為對照，越冬前后的馬鈴薯甲蟲cDNA為模板來研究脯氨酸脫氫酶的3個轉(zhuǎn)錄異型體在越冬前后表達豐度的差異。實驗結(jié)果顯示脯氨酸脫氫酶基因的3個轉(zhuǎn)錄異型體在越冬前都呈低水平表達，而脯氨酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄異型體-1在越冬后優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄表達。正常情況下，基因在3'UTR的序列越長，則其在細胞中的半衰期越短。這一結(jié)果

5、表明，為了適應(yīng)越冬后的長距離飛行需要，馬鈴薯甲蟲通過縮短3'UTR序列長度的方式，達到延長脯氨酸脫氫酶mRNA半衰期進而來提高細胞中脯氨酸脫氫酶豐度的目的，以滿足長距離飛行過程中高能量代謝的需求。
　　 三、sid-1基因cDNA片段的克隆與進化分析
　　 通過生物信息學手段對NCBI EST數(shù)據(jù)庫中類sid-1基因進行預測，而后選取幾種重要農(nóng)業(yè)害蟲（馬鈴薯甲蟲，灰飛虱，褐飛虱）的類sid-1基因進行RACE PCR克隆

6、。在褐飛虱中得到1個1137bp的5‘端序列和1個1328bp的3‘端序列，拼接得到2786bp的cDNA全長序列；在灰飛虱中得到1個792bp的5‘端序列和1個1766bp的3‘端序列，拼接得到2515bp的cDNA全長序列；在馬鈴薯甲蟲中得到1個350bp的5‘端序列。褐飛虱與灰飛虱類sid-1基因拼接序列的End-to-end PCR分別得到片段大小為2594bp與2322bp的產(chǎn)物，產(chǎn)物的測序結(jié)果與拼接得到的序列是一致的。與其他

7、物種類sid-1基因構(gòu)建的聚類樹狀圖表明拼接馬鈴薯甲蟲類sid-1基因cDNA片段與已報道的其它昆蟲的類sid-1基因具有較高的氨基酸序列同源性，且與赤擬谷盜距離最近，推測馬鈴薯甲蟲也具有類sid-1基因，具備系統(tǒng)性RNA干擾的前提條件。
　　 四、應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)獲得馬鈴薯甲蟲脯氨酸脫氫酶基因雙鏈RNA的初步研究
　　 在昆蟲中，已有通過喂食dsRNA干擾靶標基因來研究基因功能及達到植物保護目的的報道，而上述dsRN