大豆GmNHX1基因的克隆、功能初探及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、大豆[Glycinemax(L.)Merrill]是重要的油料作物和糧食作物,是世界上食用油和植物蛋白的主要來源。為了適應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求,培育優(yōu)質(zhì)抗逆大豆是大豆育種的發(fā)展方向之一。隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗逆基因轉(zhuǎn)入優(yōu)質(zhì)大豆基因組是提高其抗逆性的有效途徑。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白通過將細胞質(zhì)內(nèi)的Na+外排或?qū)a+區(qū)隔化到液泡中,來維持細胞質(zhì)的Na+穩(wěn)態(tài)和Na+/K+比相對穩(wěn)定,從而減少鹽脅迫對植株的傷害

2、。本試驗從大豆品種冀豆7號中克隆得到了耐鹽基因GmNHX1,將其轉(zhuǎn)入擬南芥驗證其與植物耐鹽的相關(guān)性;在實驗室前期工作基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化大豆胚尖再生及轉(zhuǎn)化體系;并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GmNHX1基因轉(zhuǎn)入鹽敏感性大豆品種中。結(jié)果如下:
　　 1、通過RT-PCR從大豆品種冀豆7號中克隆出Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因GmNHX1,經(jīng)生物信息學(xué)分析表明該基因與已知功能的液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白具有較高的同源性。半定量RT-PCR分析表

3、明GmNHX1屬于組成型表達,其表達受NaCl脅迫上調(diào)。鹽脅迫下葉片中GmNHX1的表達明顯高于根中,耐鹽品種冀豆7號中GmNHX1的本底表達水平比鹽敏感性大豆品種冀豆17號低,但在鹽脅迫下,冀豆7號GmNHX1的表達量較冀豆17號上調(diào)明顯。初步表明GmNHX1與大豆響應(yīng)鹽脅迫有關(guān)。
　　 2、構(gòu)建了pCAMBIA1300-35S::GmNHX1-eYFP雙元表達載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型(columbia型)擬南芥,獲得

4、了轉(zhuǎn)GmNHX1的擬南芥,經(jīng)150mMNaCl處理證明GmNHX1基因能夠明顯增加轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。
　　 3、在本實驗室前期工作基礎(chǔ)上對大豆胚尖再生體系進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,6-BA濃度在0.2～0.5mg/L時對供試4個大豆基因型的胚尖再生效果較好,其中冀豆16的再生效果最佳;TDZ濃度在0.2～1.0mg/L時對4個大豆基因型的胚尖再生效果較好,其中nf37出芽率和植株再生率最佳。
　　 4、確定了胚尖再生植株