LP4-2A融合基因在玉米中的亞細(xì)胞定位分析.pdf

1、多基因轉(zhuǎn)化是植物基因工程的研究熱點(diǎn),連接多肽的使用在一定程度上解決了傳統(tǒng)多基因轉(zhuǎn)化的不足,為構(gòu)建多基因載體提供了新的思路,而在轉(zhuǎn)基因植物中,很多基因產(chǎn)物的作用位點(diǎn)是細(xì)胞器,因此其亞細(xì)胞定位對活性的發(fā)揮極為關(guān)鍵。
　　 本研究利用人工融合的連接肽LP4／2A連接報告基因綠色熒光蛋白EGFP和紅色熒光蛋白DsRed2,在連接肽上游蛋白或下游蛋白分別或同時添加葉綠體信號肽或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽,構(gòu)建不同形式的載體,通過PEG轉(zhuǎn)化法在玉米原生質(zhì)

2、體系統(tǒng)中瞬時表達(dá),經(jīng)細(xì)胞水平和分子水平檢測由LA介導(dǎo)的融合基因體系的亞細(xì)胞定位情況。
　　 首先構(gòu)建了利用LA連接的融合基因載體pUgLr、pUCgLr、pUrLCg、pUEgLr、pUgLEr、pUCgLEr和pUErLCg,以及對照載體pUg、pUr、pUEg和pSEb,共十一個載體(U表示Ubi啟動子,g表示gfp,r表示rfp,L表示LP4／2A,C表示葉綠體信號肽Ch1,E表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽Er)。
　　 根據(jù)J

3、en Sheen實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)指南為藍(lán)本進(jìn)行操作,通過調(diào)整各個影響因素,優(yōu)化玉米原生質(zhì)體PEG瞬時轉(zhuǎn)化體系:玉米原生質(zhì)體酶解時間為7～8h,PEG濃度為30％,轉(zhuǎn)化時間為20min,原生質(zhì)體量／質(zhì)粒量為105／10μg,平均1g葉片能獲得約107個原生質(zhì)體,轉(zhuǎn)化率為30～50％。
　　 把上述構(gòu)建的載體通過PEG方法轉(zhuǎn)化到玉米原生質(zhì)體中,通過激光共聚焦顯微鏡和western blot檢測分析LP4／2A融合基因體系的亞細(xì)胞定位情況

4、,結(jié)果表明當(dāng)體系中只存在一種信號肽時,無論是葉綠體信號肽或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽,無論它們是在上游蛋白還是下游蛋白處,都能夠正確引導(dǎo)蛋白的定位,類似的當(dāng)體系中同時存在葉綠體信號肽和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽且無論它們所處的位置,它們都能使連接的蛋白正確定位,由于蛋白的未完全剪切作用,少量的融合蛋白會定位在非預(yù)期的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中,同時報告基因的位置并不會影響定位。
　　 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論:利用LP4／2A介導(dǎo)的融合基因體系能夠在玉米瞬時表達(dá)系統(tǒng)中翦切