家蠶ZNFHIT基因的原核表達以及亞細胞定位.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、在對家蠶蛹期cDNA文庫測序中，我們篩選到一條cDNA序列，通過生物信息學分析，推測可能是家蠶一鋅指蛋白基因。該基因長度為101.bp，由3個外顯子和2個內含子構成，ORF長46.bp，編碼153個氨基酸殘基，蛋白分子量17.6.kD，因此我們將其命名ZNFHIT(zin.finge.HIT)，GenBank登錄號為DY230769。
　　 通過PCR把ZNFHIT的ORF擴增后插入到載體pET-28a(+)的Bam.I和Xh.

2、I位點，獲得重組表達質粒pET-28a(+)-ZNFHIT，轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)，經PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組正確。我們利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達了含有His標簽的ZNFHIT融合蛋白，分子量合計為21167 Da。融合蛋白以不溶性的包涵體的形式存在，超聲波裂解菌體分離包涵體并離心、洗滌：對包涵體進行溶解和梯度透析復性；采用親和層析純化融合蛋白ZNFHIT。經FPLC反相柱層析進一步純化，然后進行質譜分析，得

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