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文檔簡介
1、在對家蠶蛹期cDNA文庫測序中，我們篩選到一條cDNA序列，通過生物信息學(xué)分析，推測可能是家蠶一鋅指蛋白基因。該基因長度為101.bp，由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成，ORF長46.bp，編碼153個氨基酸殘基，蛋白分子量17.6.kD，因此我們將其命名ZNFHIT(zin.finge.HIT)，GenBank登錄號為DY230769。
通過PCR把ZNFHIT的ORF擴(kuò)增后插入到載體pET-28a(+)的Bam.I和Xh.
2、I位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-ZNFHIT，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實(shí)重組正確。我們利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了含有His標(biāo)簽的ZNFHIT融合蛋白，分子量合計(jì)為21167 Da。融合蛋白以不溶性的包涵體的形式存在，超聲波裂解菌體分離包涵體并離心、洗滌：對包涵體進(jìn)行溶解和梯度透析復(fù)性；采用親和層析純化融合蛋白ZNFHIT。經(jīng)FPLC反相柱層析進(jìn)一步純化，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，得
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