家蠶BmCIB基因的原核表達及其亞細胞定位.pdf

1、鈣整合素結(jié)合蛋白(Calcium and Interin Binding protein,CIB)是含有EF-hand結(jié)構(gòu)域的鈣離子結(jié)合蛋白,可與血小板integrinαllbβ3等許多效應蛋白結(jié)合,并依賴Ca2+的調(diào)控而調(diào)節(jié)它們的功能。它在各組織中廣泛表達,作為一個重要的中間分子,在機體中執(zhí)行多種功能。目前,國內(nèi)外對鈣整合素結(jié)合蛋白的研究多數(shù)集中在脊椎動物上,而對無脊椎動物的報道很少。
　　 我們從本實驗室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA

2、文庫中獲得一條cDNA序列,通過同源序列比對后發(fā)現(xiàn)其為家蠶鈣整合素結(jié)合蛋白(Bombyx mori Calcium and IntegrinBinding protein,BmCIB)基因。該基因全長為939 bp,ORF為558 bp,編碼185個氨基酸殘基。通過擴增BmCIB基因完整的ORF序列,克隆到表達載體pET-28a(+)相應的酶切位點上,構(gòu)建了重組表達載體pET28a(+)-BmCIB。經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序證明了該重

3、組子的正確性后,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。以終濃度為1 mM的IPTG誘導,并收集菌體裂解,經(jīng)SDS-PAGE分析,在26 kD左右的位置出現(xiàn)了一條特異性蛋白條帶,與預期值(融合標簽3.56 kD,BmCIB21.16 kD)大體相符。重組蛋白以包涵體形式存在,超聲裂解菌體后12000 rpm離心,收集沉淀經(jīng)包涵體洗滌,溶解在含8 M尿素的溶解液中,再以親和層析的方法進一步純化。經(jīng)透析除鹽后,進行了質(zhì)譜分析,測定該重組蛋白的精

4、確分子量為24877.0508 Da,與其理論值24720.99 Da非常接近,可以確定該蛋白為重組的BmCIB。以純化所得重組蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔,制備了多克隆抗體,ELISA檢測該抗血清的效價在抗原濃度為10μg/mL時達到1:12800以上。用Protein A凝膠柱純化了多克隆抗體。利用熒光定量PCR的方法,對家蠶四個發(fā)育時期以及五齡幼蟲各組織中的靶mRNA的量進行比較,結(jié)果顯示其mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別以蛹期和生殖腺中最高,