產(chǎn)酶溶桿菌OH11菌株搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化和色素突變體篩選、基因克隆及特性的研究.pdf

1、由真菌、細(xì)菌、線蟲引起的植物病害的防治一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上非常重要的環(huán)節(jié)。多數(shù)病害的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥，但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用容易對環(huán)境造成污染，危害人畜健康，同時(shí)造成病原菌抗性不斷上升。而生物防治對環(huán)境污染極少，人畜安全，有時(shí)對某些有害生物可以達(dá)到長期抑制的作用，使用方便，近年來受到了廣大的關(guān)注。 產(chǎn)酶溶桿菌OHI1菌株是一種新型的生防菌，其分類地位劃分在黃單胞科，溶桿菌屬。該菌富含G+C，有滑行運(yùn)動，對由真菌、細(xì)菌引起的許多病

2、害都有生防作用，應(yīng)用前景廣闊。為了大規(guī)模發(fā)酵，降低防治成本，本研究對OHl1的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對OH11色素突變體進(jìn)行了研究。 采用單因素試驗(yàn)法對產(chǎn)酶溶桿菌OH11液體發(fā)酵的主要影響因子溫度、轉(zhuǎn)速等進(jìn)行了研究，確定了最佳培養(yǎng)條件：溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為210 rmin-1；通過正交試驗(yàn)以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對其培養(yǎng)基成分在搖瓶中進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，發(fā)酵培養(yǎng)基中活菌數(shù)在72 h時(shí)達(dá)到8.5×109 CFUml/L，明顯高

3、于原基礎(chǔ)培養(yǎng)基的結(jié)果：72 h時(shí)達(dá)到1.2×109 CFUml/L；并通過正交試驗(yàn)對搖瓶裝量、發(fā)酵時(shí)間、接種量、初始pH值4種因素進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的結(jié)果為：裝液量40 mL/250mL，發(fā)酵時(shí)間72 h，接種量108 CFU，初始pH值7.5。并且測定了產(chǎn)酶溶桿菌OH11在不同條件下的存活情況。 利用mariner轉(zhuǎn)座子對菌株OH11進(jìn)行轉(zhuǎn)座誘變，成功構(gòu)建了OH11的轉(zhuǎn)座子插入文庫。通過表型篩選，從2000多株突變株中篩選到一

4、株色素突變株OH11-1。在LB固體和液體培養(yǎng)基中，OHIl-1能產(chǎn)生黑色素。通過亞克隆的方法，我們鑒定了mariner轉(zhuǎn)座子在染色體上的插入位點(diǎn)為hmgA基因。利用自殺載體pEX18GM，通過單交換的方式，構(gòu)建了hmgA基因的插入失活突變株OHl1-2，菌株OHI1-2在表型上與OHI1-1相一致。通過基因互補(bǔ)，構(gòu)建了OHI1-2的互補(bǔ)菌株OHI1-3，OHl1-3在表型上恢復(fù)了野生型的性狀(即在固體和液體LB中不產(chǎn)生黑色素)。利用高