產(chǎn)甲酸草酸桿菌細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)系統(tǒng)hdtS基因的克隆和功能分析.pdf

1、腎結(jié)石病(Kidney stone disease)是泌尿外科常見的疾病之一，草酸鈣結(jié)石(Calcium oxalatestone，CaOx)是各種類型腎結(jié)石里最為常見的一種，占腎結(jié)石的80％以上，草酸鈣腎結(jié)石的發(fā)生與草酸在人尿中濃度高低有關(guān)。產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter formigenes，OxF）則是一株能夠以草酸作為唯一的碳源和能源的專性厭氧的革蘭氏陰性菌。目前的研究顯示，在預(yù)防治療腎結(jié)石病方面行之有效的重要手段之一就

2、是給腎結(jié)石患者服用OxF菌劑，并使之在人的腸道內(nèi)定殖。然而，很多因素影響該菌株在腸道中定殖卻制約著該菌株在臨床中的應(yīng)用發(fā)展。研究表明，很多腸道細(xì)菌的定殖受到細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing，QS)的控制。QS機(jī)制是由細(xì)菌向外界釋放一種或者幾種自誘導(dǎo)劑(Autoinducer)并通過對它們的探測進(jìn)行交流以調(diào)控群體行為的機(jī)制。
　　 革蘭氏陰性菌的細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)系統(tǒng)由產(chǎn)生自誘導(dǎo)劑?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)的合成酶和調(diào)

3、控蛋白兩部分組成。目前所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)系統(tǒng)根據(jù)其合成酶和調(diào)控蛋白大體可分為三類:LuxI-LuxR系統(tǒng)、LuxM-LuxN/AinS-AinR系統(tǒng)和HdtS。對于前兩類系統(tǒng)的研究比較深入詳細(xì)，然而第三種群體感應(yīng)系統(tǒng)的HdtS是一類明顯區(qū)別其它兩類的AHL合成酶。與hdtS基因有關(guān)的研究僅限于幾個報道，而且目前為止沒有發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)的調(diào)控蛋白。它是在2000年才被在熒光假單胞菌（Psdeuomnoda.fluorences）中發(fā)現(xiàn)的。

4、hdtS基因與大腸桿菌（Escherichia coli）的編碼溶血磷脂酸脂酰轉(zhuǎn)移酶plsC有20％的同源性，其蛋白HdtS能夠產(chǎn)生3-羥基-碳14∶1、碳10∶1或碳6∶1的三種高絲氨酸內(nèi)酯。在專性嗜酸的氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）中，Act蛋白與HdtS有37％同源性，編碼該蛋白的act基因與編碼甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS以及編碼磷酸脂酶的gph形成一個基

5、因簇。這一基因位點(diǎn)在整個變性菌門（Proteobacteria）中具有高度的保守性，基因序列也很一致。Act蛋白被證實(shí)編碼合成鏈長為14碳的?；呓z氨酸內(nèi)酯，它負(fù)責(zé)調(diào)控與氧化亞鐵硫桿菌（A.ferrooxidans）中的Lux系統(tǒng)群體感應(yīng)系統(tǒng)。
　　 產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）的兩個菌株OXCC13和HOxBLS的基因組全序列已經(jīng)被測序完成。在本研究中，我們借助已知的群體感應(yīng)效應(yīng)的模型菌株海洋費(fèi)氏弧菌(Vibri

6、ofischeri)的luxI/luxR基因、luxM/luxN基因和ainS/ainR基因以及熒光假單胞菌（P.fluorences）的hdtS基因與產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）的基因組全序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OXCC13和HOxBLS均具有兩個推測編碼1-酰基-sn-甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶(putative1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase)與hdtS基因高度同源

7、性，其中一個基因序列號為OFBG_01243(OXCC13)、OFAG_01224(HOxBLS)。我們擬使用對HOxBLS的基因組DNA為模版，進(jìn)一步對該基因序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因不僅與熒光假單胞菌(P.fluorences)的hdtS基因高度同源，而且與目前被鑒定的編碼HdtS型AHL合成酶的氧化亞鐵硫桿菌（A.ferrooxidans）中的act基因也高度同源。此外，而且產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）中hdtS基因與編碼

8、甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS以及編碼磷酸脂酶的gph形成一個基因簇，這與氧化亞鐵硫桿菌(A.ferrooxidans)中的act基因與編碼甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS以及編碼磷酸脂酶的gph形成的基因簇的基因順序也高度一致的。因此，我們推測產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）中這一與hdtS/act有高度同源性的基因很可能就是編碼HdtS類的群體感應(yīng)系統(tǒng)的候選基因。然而，在分析過

9、程當(dāng)中還意外發(fā)現(xiàn)另一個基因被推測編碼1-?；?sn-甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶(putative1-acyl-sn-glycerol-3-phosphateacyltransferase)，該基因與上述的hdtS基因，與熒光假單胞菌（P.fluorences）的HdtS蛋白，及氧化亞鐵硫桿菌（A.ferrooxidans）中的Act蛋白均斗具有一定的同源性。在產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）中，既然AGPA與HdtS均被推測為1-酰

10、基-sn-甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶，且二者具有一定同源性，AGPA與其它兩個被鑒定的HdtS型AHL合成酶也有一定同源性，所以我們選擇AGPA基因作為另一個AHL合成酶的候選基因。
　　 為了獲得hdtS與AGPA的片段，我們利用PCR手段以（O.formigenes）HOxBLS基因組DNA為模板，分別體外擴(kuò)增兩個基因片段。并通過T-A克隆的方法將其與pEASY-T3載體連接，得到幾個陽性克隆，并通過菌落PCR，雙酶切的方法對其進(jìn)

11、行驗(yàn)證。然后，選擇其一進(jìn)行測序，得到了與理論上基因序列一致的陽性克隆子。為了驗(yàn)證這兩段基因是否具有高絲氨酸內(nèi)酯合成酶的功能，我們將hdtS與AGPA構(gòu)建到表達(dá)載體pET19中，檢驗(yàn)結(jié)果，其能夠得到表達(dá)及大量的可溶性蛋白，并且蛋白大小與預(yù)測的蛋白大小基本一致。這為接下來驗(yàn)證這兩種基因的功能提供了有力的理論依據(jù)。最終，我們利用平板菌株報告法對這兩段基因是否具有高絲氨酸內(nèi)脂合成酶進(jìn)行初步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)hdtS確實(shí)具有該合成酶功能，而AGPA卻并沒

12、有這種功能。在這一初步結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了能更準(zhǔn)確并有選擇性地檢測到高絲氨酸內(nèi)脂，我們準(zhǔn)備利用GC-MS的方法對BL21/pET19-hdtS細(xì)菌提取物進(jìn)行檢測，達(dá)到對其定性的目的。
　　 至今為止，沒有任何產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）的細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)系統(tǒng)的有關(guān)基因的報道。既然產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）是極其重要的治療和預(yù)防腎結(jié)石疾病的益生菌，所以對于該基因的克隆及功能分析對于該菌株的群體感應(yīng)系統(tǒng)的了