水楊酸對粉葛愈傷組織黃酮含量及抗氧化活性影響.pdf

1、目前，影響藥用植物細胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的限制因素，主要有兩點：一是藥用植物細胞生長緩慢，生物量低；二是培養(yǎng)細胞的次生產(chǎn)物合成的產(chǎn)量很低。研究如何提高藥用植物細胞次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量對解決植物培養(yǎng)細胞次生物質(zhì)的低產(chǎn)問題具有重要理論和實際指導(dǎo)意義。
　　 粉葛，Pueraria thomsonii Benth，富含葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物，在我國及其他東亞國家廣泛用作醫(yī)藥業(yè)、食品業(yè)和輕工業(yè)原料。本試驗以

2、粉葛愈傷組織為材料，研究了水楊酸誘導(dǎo)子對粉葛細胞生長、次生代謝產(chǎn)物含量及粉葛提取物的抗氧化活性的影響，為粉葛細胞工程生產(chǎn)葛根素等異黃酮類化合物奠定了基礎(chǔ)。研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)培養(yǎng)條件對粉葛愈傷組織生長及總黃酮含量的影響
　　 為獲得穩(wěn)定且最優(yōu)的細胞生長和產(chǎn)黃酮類次生產(chǎn)物量較高的培養(yǎng)條件，對培養(yǎng)基組成成分(細胞分裂素和生長素)、pH值、蔗糖濃度、培養(yǎng)溫度和接種量等條件進行優(yōu)化，得到了粉葛愈傷組織細胞最適

3、的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為MS+1.5×10-5M2,4-D+2×10-6M BA,30g/L蔗糖，pH5.8，培養(yǎng)溫度25℃，7.5g/L瓊脂、接種量為3g/50mL。且粉葛愈傷組織細胞生長周期為30d。由粉葛愈傷組織建立的細胞系生長呈“S”型曲線，最適繼代周期為16d。
　　 (2)水楊酸對粉葛愈傷組織生長及黃酮含量的影響
　　 以水楊酸為誘導(dǎo)子添加到粉葛愈傷組織中，研究水楊酸的不同添加時間、添加濃度和誘導(dǎo)時間對培養(yǎng)物生長

4、和黃酮含量的影響，最后得出水楊酸的誘導(dǎo)以培養(yǎng)第13d加入，添加濃度為2μmol/L，誘導(dǎo)3h效果最為明顯，黃酮含量達到5.336mg/g，較對照組提高了41％。
　　 在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法的Box-Benhnken實驗設(shè)計，設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面。在分析各個因素的顯著性和交互作用后，得出最佳工藝條件為：添加時間13.11d、誘導(dǎo)濃度1.76μmol/L、誘導(dǎo)時間3.09h，此時誘導(dǎo)后黃酮含量的理論值為5.42

5、mg/g。
　　 研究了粉葛愈傷組織中黃酮類化合物的超聲波提取條件。結(jié)果表明，提取粉葛黃酮的最佳提取工藝為超聲時間40min、乙醇濃度75％、料液比1:20、超聲溫度60℃、超聲功率為100W、浸提次數(shù)為2次。經(jīng)測定粉葛總黃酮含量為7.146mg/g。
　　 在乙醇濃度和超聲時間的單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法的中心組合設(shè)計，優(yōu)化粉葛愈傷組織中黃酮化合物的超聲提取條件乙醇濃度和超聲時間對黃酮得率的影響。用Desig

6、n-Expert進行結(jié)果分析，響應(yīng)面的典型分析可知穩(wěn)定點是最大值，決定系數(shù)為0.9455。黃酮最佳超聲提取工藝條件為：乙醇濃度74.6％，超聲提取時間44min,料液比1:20，超聲提取溫度60℃，浸提次數(shù)2次，在此條件下黃酮含量為7.33mg/g。
　　 (4)粉葛愈傷組織提取物抗氧化活性的研究
　　 采用DPPH體系、羥基自由基體系、超氧陰離子自由基體系對經(jīng)SA(水楊酸)誘導(dǎo)的粉葛提取物的抗氧化活性進行研究，并同BH

7、T的抗氧化活性進行了比較。結(jié)果表明：提取物對三種自由基均有清除作用，在配制的不同質(zhì)量濃度的粉葛提取物溶液中，在一定的濃度范圍內(nèi)，粉葛提取物對DPPH自由基、超氧自由基O2-．和羥基自由基·OH清除率隨著濃度的升高呈上升趨勢，在一定濃度下，經(jīng)SA誘導(dǎo)后粉葛提取物對DPPH、O2-·、·OH的清除率最高分別是90.63％、62.68％、71.88％，分別比相同濃度下對照組提高了24.54％、13.1％、28.7％。在一定使用量的條件下其抗氧