嗜麥芽窄食單胞菌L1、L2和AmpR基因變異與抗生素誘導(dǎo)耐藥性變化研究.pdf

1、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltohilia，Sm)為機(jī)會(huì)致病菌可引起人與動(dòng)物患病，該菌有多重耐藥性和高耐藥性，對(duì)多數(shù)抗菌藥物和消毒劑耐藥。產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)多數(shù)抗菌藥物尤其是β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因。該菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，主要有L1和L2酶，L1酶是金屬β-內(nèi)酰胺類酶，能夠水解青霉素類、頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑和大多數(shù)碳青霉烯類;L2酶能水解頭孢菌素、單環(huán)頭孢菌素。這兩種酶均為

2、可誘導(dǎo)性酶，可在抗生素壓力下高水平表達(dá)，從而使該菌對(duì)抗生素耐藥性增加，L1、L2酶的誘導(dǎo)表達(dá)依賴于調(diào)節(jié)基因AmpR的存在。
　　 為了解嗜麥芽窄食單胞菌L1、L2和AmpR基因的變異與抗生素誘導(dǎo)耐藥性變化規(guī)律，本研究通過(guò)對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌臨床菌株的耐藥性分析及L1、L2和AmpR基因序列分析，分析序列差異規(guī)律，并尋找序列變異與耐藥程度的相關(guān)性。通過(guò)不同濃度的兩種抗生素誘導(dǎo)，分析誘導(dǎo)前后AmpR、L2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及變化;

3、分析誘導(dǎo)前后L1、L2酶的產(chǎn)生及酶學(xué)特性的變化，確定抗生素對(duì)兩種酶的誘導(dǎo)作用及差異;分析誘導(dǎo)前后AmpR、L2基因序列有無(wú)變化以及誘導(dǎo)前后菌株耐藥程度的變化，從而了解而抗生素誘導(dǎo)對(duì)基因和耐藥性的影響。
　　 試驗(yàn)一嗜麥芽窄食單胞菌耐藥性及L1、L2和AmpR基因的變異分析
　　 將99株院內(nèi)分離的嗜麥芽窄食單胞菌臨床菌株，采用K-B紙片法和Etest試驗(yàn)分別分析耐藥表型。所測(cè)臨床菌株對(duì)頭孢曲松、哌拉西林耐藥率高這96.9

4、7％，對(duì)頭孢噻肟、氨曲南的耐藥率達(dá)90％以上，對(duì)左氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感性較高，而左氧氟沙星比環(huán)丙沙星敏感性更高，敏感率分別為85.86％和69.70％。所測(cè)臨床菌株絕大部分為多重耐藥菌，93.9％菌株的對(duì)兩種及兩種以上的抗菌藥物耐藥。通過(guò)PCR擴(kuò)增L1、L2和AmpR基因序列，分析高、中、低耐藥程度菌株中L1、L2和AmpR基因的編碼區(qū)序列差異，分析這種序列的差異是否直接跟耐藥的程度有關(guān)。99株菌中有22株L1基因陽(yáng)性，對(duì)22株L1基

5、因序列分析顯示，L1同源性較高，突變位點(diǎn)較少，而含有L1基因的菌株其耐藥程度較高。78株臨床菌株的AmpR和L2陽(yáng)性，其編碼區(qū)氨基酸與GenBank注冊(cè)的AmpR和L2基因氨基酸進(jìn)行同源性比較，L2編碼區(qū)存在對(duì)菌株耐藥性有不同影響的三組變異。
　　 試驗(yàn)二抗生素誘導(dǎo)對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌L2和AmpR基因轉(zhuǎn)錄的影響
　　 本研究從轉(zhuǎn)錄水平分析該酶的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)方法，研究不同濃度1/4

6、，1，4×MIC（最低抑菌濃度）亞胺培南(IP)、哌拉西林/他唑巴坦(PTC)為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)前后AmpR、L2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化。不同濃度的PTC比IP誘導(dǎo)后AmpR和L2表達(dá)量都明顯增多，且PTC在1×MIC誘導(dǎo)時(shí)，AmpR和L2表達(dá)量最高。兩種抗生素誘導(dǎo)，AmpR比L2表達(dá)量低。嗜麥芽窄食單胞菌在不同的抗生素壓力下可誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶不同程度表達(dá)。
　　 試驗(yàn)三抗生素誘導(dǎo)對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌L1、L2酶的特性、基因變異及

7、耐藥性的影響
　　 本試驗(yàn)研究了在不同濃度抗生素的誘導(dǎo)下，誘導(dǎo)前后L1、L2酶的特性的變化，確定抗生素對(duì)兩種酶的誘導(dǎo)作用及差異。通過(guò)序列分析確定誘導(dǎo)前后AmpR、L2基因序列有無(wú)變化;通過(guò)測(cè)定不同抗生素MIC值，分析誘導(dǎo)前后菌株耐藥程度的變化。經(jīng)IP和PTC在4×MIC誘導(dǎo)后，酶的總活性最高。隨著誘導(dǎo)抗生素濃度升高其L1和L2酶的總活性升高，經(jīng)PTC誘導(dǎo)L1、L2酶都相應(yīng)升高，而用IP誘導(dǎo)L1酶活性明顯升高，L2酶活性略有下降。