北京地區(qū)臨床分離嗜麥芽窄食單胞菌的耐藥機制與治療策略研究.pdf

1、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，S.maltophilia）是醫(yī)院感染重要的病原體，在免疫缺陷患者和重癥監(jiān)護室患者可以引起嚴重的肺部感染、血液感染和尿路感染感染等多種醫(yī)院感染，具有很高的發(fā)病率和死亡率。S.maltophilia也是醫(yī)院常見的多重耐藥菌，對包括碳青霉烯類的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類等多種抗菌藥物天然耐藥，臨床上可選擇的治療藥物十分有限?；前芳讎f唑/甲氧芐啶(SXT)

2、是目前唯一推薦的一線治療藥物，但近些年來，隨著磺胺耐藥sul基因的全球范圍內(nèi)的流行，SXT耐藥問題日益嚴重。目前缺乏北京地區(qū)S.maltophilia對SXT、替加環(huán)素的耐藥機制研究，國際上也沒有SXT耐藥的S.maltophilia的標準治療方案。
　　目的:
　　1.建立磺胺耐藥sul基因的LAMP檢測方法，對sul耐藥基因在北京地區(qū)醫(yī)院分離S.maltophilia的流行情況進行調(diào)查，為制定針對性的經(jīng)驗性治療策略和防控

3、措施提供依據(jù)。
　　2.明確北京地區(qū)臨床分離S.maltophilia對替加環(huán)素耐藥的主要耐藥機制。
　　3.對SXT耐藥S.maltophilia，通過體外藥敏實驗、時間-殺菌曲線實驗和防耐藥突變（Mutant Prevention Concentration，MPC）實驗，選擇體外殺菌效果好、防耐藥突變能力強的抗感染治療方案。
　　方法:
　　1.建立磺胺耐藥sul1和sul2基因的環(huán)介導恒溫擴增檢測方法（L

4、oop-MediatedIsothermal Amplification，LAMP），并對其特異性和敏感性進行驗證。使用建立LAMP檢測方法，對2012-2014年北京地區(qū)解放軍總醫(yī)院、協(xié)和醫(yī)院和空軍總醫(yī)院收集的450株S.maltophilia中sul基因進行篩查;檢測sul基因陽性S.maltophilia對臨床常用的17種抗菌藥物的體外抗菌活性。
　　2.檢測了北京地區(qū)450株臨床分離非重復S.maltophilia對SXT

5、、米諾環(huán)素等8種臨床常用抗菌藥物的體外抗菌活性。根據(jù)S.maltophilia對替加環(huán)素的體外藥敏結(jié)果，將450株S.maltophilia分為替加環(huán)素不敏感組（TNS，MIC＞2ug/ml）和敏感組(TSS，MIC≤2ug/ml);比較TNS和TSS兩組S.maltophilia對其余7種抗菌藥物的體外敏感性;從TNS和TSS組中各隨機選擇48株菌株，比較其四環(huán)素特異性耐藥基因的攜帶率及多重耐藥外排泵表達水平之間的差異，從而明確北京地

6、區(qū)S.maltophilia對替加環(huán)素的主要耐藥機制。
　　3.收集了北京地區(qū)解放軍總醫(yī)院、協(xié)和醫(yī)院和空軍總醫(yī)院2014-2015年60株臨床分離的非重復SXT耐藥S.maltophilia，檢驗其對文獻報道的11種潛在治療藥物的體外抗菌活性，選擇出敏感性最高的幾種抗菌藥物;對選擇出的敏感性最高的幾種藥物進行體外單藥和聯(lián)合的時間-殺菌曲線實驗，選擇出24h體外殺菌效果最好的聯(lián)合用藥方案;對選擇出的協(xié)同抗菌活性最好的聯(lián)合用藥方案進行

7、MPC實驗，驗證其抑制防耐藥突變的能力。
　　結(jié)果:
　　1.(1)我們設計了磺胺耐藥sul1和sul2基因的LAMP檢測引物，2組引物都具有很高的特異度與靈敏度。臨床分離的56株SXT耐藥S.maltophilia都攜帶sul基因，394株SXT敏感S.maltophilia中，也有16株(4.1％)攜帶sul基因。(2) sul基因陽性S.maltophilia對四環(huán)素衍生物有很好的體外抗菌活性，其中對米諾環(huán)素的敏感性最

8、高（MIC50/MIC90:0.5/4; S％:95.4％），對多西環(huán)素和替加環(huán)素的敏感性都為68.1％;對新氟喹諾酮類抗菌藥物（莫西沙星和左氧氟沙星）和卡西林/克拉維酸也有很高的敏感性。除了這6種藥物，對其他11種臨床常用抗菌藥物敏感率的都低于50％。
　　2.(1)替加環(huán)素對北京地區(qū)臨床分離的S.maltophilia有很好的體外活性(MIC50/MIC90:1/8;S％:77.78％)。TSS組S.maltophilia對米

9、諾環(huán)素(100％)，SXT(89.71％)，多西環(huán)素(97.71％)，左氧氟沙星(82.00％)和替卡西林/克拉維酸(76.86％)都有很好的體外抗菌活性，而TNS組S.maltophilia只對米諾環(huán)素(94.00％)，SXT(80.00％)和替卡西林/克拉維酸(73.00％)具有很好的體外敏感性，對多西環(huán)素(25％)和左氧氟沙星(17％)的敏感性都非常低。統(tǒng)計學結(jié)果顯示，TNS組S.maltophilia對多西環(huán)素和左氧氟沙星的敏感

10、率遠低于TSS組(25.00％ V.s97.71％，P＜0.001;17.00％ V.s82.00％, P＜0.001)。
　　(2)臨床分離S.maltophilia對四環(huán)素特異性的耐藥tet基因的攜帶率很低，且TNS與TSS兩組無統(tǒng)計學差異。TNS組S.maltophilia多重耐藥外排泵基因SmeD的表達水平明顯高于TSS組(非參數(shù)檢驗，P＜0.001)。其他5種外排泵smeA，smeD, smeI,smeO, smeW,

11、smrA基因的表達水平均無統(tǒng)計學差異。左氧氟沙星和多西環(huán)素的非敏感組菌株smeD表達水平與的各自對應的敏感組菌株相比明顯升高，而其他5種的外排泵的表達水平之間均不存在統(tǒng)計學差異。
　　3.(1)北京地區(qū)SXT耐藥的S.maltophilia對四環(huán)素類衍生物、新氟喹諾酮類和替卡西林/克拉維酸具有很好的體外抗菌活性，其中以米諾環(huán)素的敏感性最高(MIC50/MIC9:0.5/4; S％:96.67％)。除了這3類藥物，其他幾種抗菌藥物對

12、S.maltophilia敏感率的都低于30％。(2)殺菌曲線結(jié)果顯示莫西沙星單藥對敏感菌株有很好的殺菌作用;米諾環(huán)素和替卡西林則對敏感菌株只表現(xiàn)為抑菌活性。米諾環(huán)素與替卡西林/克拉維酸聯(lián)合使用時無協(xié)同抗菌活性;米諾環(huán)素聯(lián)合莫西沙星時，但是對于莫西沙星敏感菌株會有拮抗作用，非敏感菌株可變現(xiàn)為協(xié)同或者無關作用，莫西沙星與替卡西林/克拉維酸體外聯(lián)合協(xié)同抗菌活性與菌株的MIC值密切相關，對于莫西沙星的敏感菌株，莫西沙星單藥與兩藥組合菌表現(xiàn)出良

13、好的殺菌活性;對于莫西沙星中介菌株（MIC=4ug/ml），兩藥聯(lián)合表現(xiàn)為協(xié)同抗菌作用;對于莫西沙星耐藥菌株，不具有協(xié)同抗菌活性。(3)莫西沙星對20株S.maltophilia的MPC范圍為4-32μg/ml，MPC50/MPC90為16/32μg/ml，選擇指數(shù)SI范圍為4-32;替卡西林/克拉維酸對20株菌的MPC均＞128/2μg/mL，選擇指數(shù)SI范圍為＞8/2-＞64μg/mL。莫西沙星聯(lián)合32/2μg/mL替卡西林/克拉維

14、酸后MPC范圍為降為1-8μg/ml，MPC50/MPC90下降為2/4μg/mL，選擇指數(shù)SI范圍降為1-8。單藥MPC實驗中，莫西沙星400mg q24的群體藥代學參數(shù)平均血藥濃度（2μg/ml）在低于所有20株菌株的MPC，血藥峰濃度(4.5μg/ml)的抑菌突變率只有10％。莫西沙星聯(lián)合32/2μg/mL替卡西林/克拉維酸MPC后，莫西沙星人體平均血藥濃度累計抑菌突變率可達到70％，血藥峰濃度抑菌突變率高于95％。
　　結(jié)

15、論:
　　1.(1)我們設計磺胺耐藥sul1和sul2基因的LAMP檢測引物，能夠快速、特異的檢測sul1和sul2基因;sul基因是北京地區(qū)S.maltophilia對SXT耐藥的主要耐藥機制。(2)四環(huán)素類衍生物、替卡西林/克拉維酸、及新氟喹諾酮類抗菌藥物對北京地區(qū)sul陽性S.maltophilia具有很好的體外抗菌活性，可以作為經(jīng)驗性抗菌治療藥物，其中米諾環(huán)素的敏感性最高，可以作為首選藥物。
　　2.北京地區(qū)S.ma

16、ltophilia對替加環(huán)素、多西環(huán)素和左氧氟沙星耐藥的主要機制相同，都為多重耐藥外排泵基因SmeDEF的高表達。四環(huán)素衍生物和氟喹諾酮類藥物可以成為彼此耐藥性產(chǎn)生的誘導因素，臨床上需要合理使用抗菌藥物，防止耐藥性的傳播。
　　3.(1)四環(huán)素類衍生物、新氟喹諾酮類和替卡西林/克拉維酸對北京地區(qū)臨床分離的SXT耐藥的S.maltophilia具有很好的體外抗菌活性，可以作為藥敏結(jié)果出來前的經(jīng)驗性抗感染藥物，其中以米諾環(huán)素的敏感性最

17、高，可以作為首選藥物。(2)莫西沙星與替卡西林/克拉維酸的協(xié)同抗菌活性與莫西沙星對S.maltophilia的MIC密切相關:莫西沙星單藥和兩藥聯(lián)合方案對莫西沙星敏感菌株有很強的殺菌作用;對中介菌株也有很好的協(xié)同性抗菌活性，對于藥菌株沒有協(xié)同抗菌活性。(3)莫西沙星聯(lián)合32/2μg/mL替卡西林/克拉維酸，能夠降低莫西沙星的MPC;聯(lián)合用藥時，莫西沙星400mg q24h群體藥代學參數(shù)平均血藥濃度和血藥峰濃度，都能夠有效抑制大多數(shù)敏感菌