楊樹PtCDD基因的原核表達(dá)及酶活分析.pdf

1、木材形成是形成層細(xì)胞分化為木質(zhì)部細(xì)胞，包括細(xì)胞的膨大、次生壁沉積及細(xì)胞的程序化死亡(PCD)的過(guò)程，核酸酶是其細(xì)胞最終死亡的重要參與者之一，對(duì)它的進(jìn)一步研究不但為PCD過(guò)程提供分子生物學(xué)證據(jù)，認(rèn)識(shí)樹木木材形成的PCD過(guò)程的特征，研究其凋亡機(jī)制是否與動(dòng)物一樣，還是有其自身途徑，而且有助于揭示木材形成的分子基礎(chǔ)，并回答次生壁的形成與細(xì)胞PCD的時(shí)間關(guān)系問題。因此本論文對(duì)楊樹核酸酶的進(jìn)一步體外表達(dá)、產(chǎn)物純化、鑒定，將為揭示木材形成的PCD過(guò)程

2、提供重要的依據(jù)，有其重要的理論價(jià)值，而且通過(guò)認(rèn)識(shí)PCD過(guò)程在木材形成過(guò)程中的作用，為木材品質(zhì)的改良奠定理論基礎(chǔ)。 本研究從來(lái)自毛白楊形成層區(qū)域獲得的cDNA中擴(kuò)增得到Ca2+依賴型DNase(PtCDD)全長(zhǎng)基因并將其與原核表達(dá)載體pET-30b(+)相連接，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30b(+)-PtCDDI。并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中。通過(guò)改變各種外界環(huán)境條件，均未得到目的蛋白。表明該基因的全長(zhǎng)表達(dá)可能會(huì)對(duì)大

3、腸桿菌或載體本身產(chǎn)生重要影響，不能獲得大量表達(dá)產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)該基因結(jié)構(gòu)的分析，克隆了該基因的催化功能域和Ca2+結(jié)合域的一部分，以期能夠降低該蛋白與DNA的結(jié)合能力，使其能夠在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)。將擴(kuò)增出的包含該P(yáng)tCDD功能域的基因片段與原核表達(dá)載體pET-30b(+)相連接，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30b(+)-PtCDDF，對(duì)原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)該蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其積累并形成包涵體。對(duì)楊樹PtCDD蛋