HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因原核與真核的構(gòu)建及表達(dá)研究.pdf

1、棉鈴蟲(chóng)是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一，常常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期大量的使用，不僅使得棉鈴蟲(chóng)的抗藥性劇增，且污染環(huán)境。棉鈴蟲(chóng)單核衣殼核多角體病毒(HaSNPV)是棉鈴蟲(chóng)專(zhuān)一性病原微生物，具有寄主范圍特異、對(duì)靶標(biāo)高毒力、無(wú)藥害、使用安全、害蟲(chóng)不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，是理想的害蟲(chóng)控制因子。但傳統(tǒng)病毒殺蟲(chóng)劑殺蟲(chóng)作用緩慢、范圍窄等限制了它的使用。在HaSNPV基因組中發(fā)現(xiàn)的18家族幾丁質(zhì)酶基因是一個(gè)晚期非必需基因，與受染蟲(chóng)體液化和病毒侵染機(jī)制密

2、切相關(guān)，因而對(duì)該基因進(jìn)行深入研究，將對(duì)病毒殺蟲(chóng)劑的遺傳改良和新的表達(dá)系統(tǒng)的建立有著重要的意義。 在研究中，將HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建到具有高效分泌，且易于外源蛋白正確折疊的原核表達(dá)載體pMAL-p2X中，以期得到可溶性目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法構(gòu)建重組體，DNA測(cè)序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌TB1，以IPTG為誘導(dǎo)劑，采用26℃低溫下，誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，得到了融合蛋白，其量約占總蛋白的14.7％，上清中分泌的可溶

3、目的蛋白含量約占總目的蛋白的20％以上。此研究為下一步的純化、制備特異性抗體、蛋白的復(fù)性和生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。 為了克服HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中存在的不易分離純化、蛋白無(wú)活性等問(wèn)題，本研究改用真核表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)中，首先將目的基因克隆構(gòu)建到過(guò)渡載體pMD18-T-Vecter中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、酶切和鑒定，再將目的基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中，測(cè)序鑒定重組子正確后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，以甲醇為