彩葉草的查爾酮異構(gòu)酶（CHI）基因的遺傳轉(zhuǎn)化及其功能驗(yàn)證.pdf

1、類黃酮是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，亦稱維生素P，常與維生素C伴存，普遍存在予蔬菜、水果、花和谷物中的天然色素，因多呈黃色而稱生物類黃酮。參與植物花色的形成、UV防護(hù)、抵抗病原體、花粉發(fā)育、植物激素的運(yùn)輸以及豆科植物根瘤菌的相互作用，具有十分重要的生理功能。至今已分離鑒定出的有4000多種。許多研究證實(shí)，類黃酮在人體中具有多種生物活性，包括抗氧化、自由基清除、抗病毒、抗發(fā)炎、血管舒張活性等，在某些情況下也有金屬螯合特性。查爾酮異構(gòu)酶(Cha

2、lcone Isomerase，CHI，EC 5.5.1.6)是類黃酮合成途徑早期階段的關(guān)鍵酶之一。是植物花色素苷生物合成平和豆科異黃酮植物抗毒素合成所必需的酶，以單體的形式普遍存在于大多數(shù)植物中，其蛋白的三維折疊結(jié)構(gòu)在植物中具有唯一性，已被看成一種植物特有的基因標(biāo)記。因此，CHL基因調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)于了解豆科植物異黃酮生物合成特性、增加藥用植物類黃酮的生物合成和花色形成的分子機(jī)制有重要的意義。 1、CHI基因的正向和反向植物表

3、達(dá)載體的構(gòu)建 用X-baⅠ和Sma Ⅰ雙酶切PUCm-CHl和中間載體PTripEx2，回收、連接目的片段與載體。構(gòu)建中間載體pT-CHIs和pT-CHIa重組質(zhì)粒。用X-baⅠ和SmaⅠ雙酶切pT-CHIs和pT-CHIa和表達(dá)載體質(zhì)粒pC2301-35S-Nos，回收、連接目的片段與載體，分別構(gòu)建成正反向植物表達(dá)載體pC2301-CHIs和pC2301-CHIa。采用凍融法把pC2301-CHIs和pC2301-CHIa分別

4、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。 2、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CHI基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化 將-80℃下保存的農(nóng)桿菌菌種LBA4404接種到Y(jié)EB+Km50mg/L+Sm125mg/L的培養(yǎng)基平板上，27-28℃倒置培養(yǎng)2-3d。菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落接種丁含Km 50mg/L，Sm 125mg/L的液體YEB培養(yǎng)基中，27-28℃，1 80rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8。取OD6m為0.6-0.8的農(nóng)桿菌菌液1-2μl，加

5、入到20-25ml的YEB中，搖菌至OD600約為0.8，備用。 取煙草的無(wú)菌苗葉片，切成5mmxSmm大小，浸入備好的農(nóng)桿菌菌液(OD600=0.2)中感染5-10min，其間不斷振蕩使菌液與葉片充分接觸。濾去菌液，取出葉片，用無(wú)菌濾紙吸干葉片表面多余的菌液，轉(zhuǎn)入鋪有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA中。葉片背面朝向培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2-3d。共培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入選擇分化培養(yǎng)基MS+2.0mg/L

6、 6-BA+0.5mg/L IAA+200mg/L Km+500mg/LCe沖進(jìn)行選擇培養(yǎng)，20d繼代一次，直到分化出芽(需要45-60d)。當(dāng)分生不定芽達(dá)1cm以上時(shí)。切下不定芽。轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基1/2MS+2.0mg/L 6-BA十0.5mg/L IAA+100mg/L Km+200mg/L Cef進(jìn)行生根篩選。用農(nóng)桿菌(含有正向表達(dá)載體質(zhì)粒PC2301-CHIs)轉(zhuǎn)化煙草(W38)，所得轉(zhuǎn)化株系命名為W+。用農(nóng)桿菌(含有反向表達(dá)

7、載體質(zhì)粒PC2301-CHIa)轉(zhuǎn)化煙草(W38)，所得轉(zhuǎn)化株系命名為W-。未轉(zhuǎn)化的煙草對(duì)照株系命名為W0。統(tǒng)計(jì)結(jié)果，W+獲得23株存活的抗性苗；W-獲得20株存活的抗性苗：W0獲得10株。 3、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和轉(zhuǎn)基因植株類黃酮、花色素苷含量測(cè)定 將轉(zhuǎn)化植株的葉片浸于GUS染液中染色，再對(duì)已染上色的植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。得到檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株、W+為12株，W-為13株。 對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株