苦瓜幾丁質酶-益母草抗菌肽雙價基因（CHI-AFP）遺傳轉化玉米的研究.pdf

1、玉米是現代食品、飼料、醫(yī)藥及化工的主要原料作物。2006年我國玉米種植面積達到2690萬公頃，約占我國耕地總面積的20％。病蟲害尤其是真菌病害是影響玉米產量及品質的主要因素之一，每年真菌病害造成的損失高達總產量的10-20％，甚至更多。目前防治真菌病害的方法主要以化學藥物防治為主，其成本高，且真菌易產生抗藥性，造成環(huán)境污染。培育抗病品種無疑是最經濟有效的方法，但玉米抗性資源比較缺乏，且常規(guī)育種耗時費力，利用基因工程技術對玉米品種進行定向

2、改良，是獲得抗病品種的快捷、有效途徑。幾丁質酶可分解真菌細胞壁重要組成成分幾丁質，抑制真菌的生長和增殖，從而起到防御病原真菌的作用；抗菌肽是一類新型的抗菌物質，其抗菌譜廣、抗菌活性高。本研究通過農桿菌介導和基因槍兩種方法將含有單價苦瓜幾丁質酶基因(CHI)及其與益母草抗菌肽基因(AFP)的雙價表達載體遺傳轉化玉米，得到如下結果： 1、研究了不同大小幼胚對愈傷誘導率及愈傷質量的影響。結果表明1.0-2.0mm的幼胚愈傷組織誘導頻率

3、高達90％以上且誘導的愈傷質量較好：生根培養(yǎng)基中附加2mg·L<'->多效唑不僅能促進生根，且植株健壯，易于移栽成活。 2、優(yōu)化了影響農桿菌介導法轉化玉米的因素。探討了預培養(yǎng)、侵染時間、不同濃度乙酰丁香酮和篩選方式對轉化效率的影響，研究發(fā)現轉化受體采用預培養(yǎng)6-9d的處于旺盛分裂期的胚性愈傷；侵染時間為10min；重懸液和共培養(yǎng)基均附加100μM的乙酰丁香酮；延遲1周篩選，在此參數下轉化效率達24.25％；比較基因槍法轉化中轟擊

4、距離對轉化的影響，發(fā)現轟擊距離為9cm較為適合玉米轉化，轉化率達到35％左右。 3、轉基因植株的鑒定GUS染色鑒定：取抗性愈傷和轉化植株的葉片進行GUS染色，均出現了藍色，表明GUS基因已經導入并表達。PCR鑒定：提取轉化植株和對照植株葉片基因組DNA進行PCR擴增，轉化植株擴增出401bp大小的目的片段而對照植株則無，進一步說明目的基因已整合至植物基因組DNA。除草劑抗性鑒定：取轉基因和對照植株葉片插入含除草劑草丁膦為200m