F18ab+大腸桿菌hcp基因缺失株的構(gòu)建及其對(duì)重要毒力因子分泌功能的影響.pdf

1、[研究背景]產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)F18ab菌株是引起斷奶仔豬腹瀉和水腫病的重要致病菌，長(zhǎng)期以來(lái)給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大損失，掌握該致病菌的致病機(jī)制達(dá)到防控疾病發(fā)生成為科研工作者長(zhǎng)期的目標(biāo)。該菌強(qiáng)大的致病力主要源自于它的毒力因子，包括Ⅰ型菌毛、F18ab菌毛、鞭毛、AIDA(adhesininvolvedindiffuseadherence)、stx2e等。而這些毒力因子有的分布在菌體的外表面，起著粘附宿主細(xì)胞的作用，有的分泌在

2、菌體外環(huán)境中，破壞宿主細(xì)胞，這些毒力因子都需要細(xì)菌本身的分泌途徑在它們合成和表達(dá)完成以后運(yùn)輸?shù)骄w外，這個(gè)分泌的過(guò)程在很大程度上影響了細(xì)菌的致病力。[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯探索F18ab大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)中hcp基因在其重要毒力因子分泌過(guò)程中的作用，為預(yù)防和控制大腸桿菌病尋找新的切入點(diǎn)。[實(shí)驗(yàn)方法]基于hcp基因的已知序列，利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)敲除Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)hcp基因。首先合成一對(duì)引物（引物與E.coli菌株的hc

3、p基因序列5’端同源）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株(E.coliF18ab)是否含有hcp基因，獲得其基因序列。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)菌株的hcp基因序列合成一對(duì)引物（引物5’端與hcp基因同源，3'端與氯霉素抗性基因cat同源）用來(lái)獲得帶氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌F18ab菌株中，在Red重組系統(tǒng)表達(dá)重組酶的幫助下，氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物通過(guò)其兩側(cè)的hcp基因同源序列與大腸桿菌染色體上的hcp基因發(fā)生同源重組，通過(guò)氯霉素抗性平板篩選得到陽(yáng)

4、性克隆，對(duì)篩選得到的陽(yáng)性克隆再導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，通過(guò)第二次重組去除抗性基因，結(jié)合PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果，證明hcp基因缺失株F18ab△hcp的正確構(gòu)建。然后比較分析該突變?nèi)笔е昱c野生株的生物學(xué)特性（主要包括細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，生化反應(yīng)，運(yùn)動(dòng)能力，體外IPEC-J2細(xì)胞粘附和侵襲能力，小鼠排毒帶菌量變化以及對(duì)Vero細(xì)胞的殺傷力能等幾個(gè)方面）。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]同F(xiàn)18ab野生株相比，△hcp突變株的運(yùn)動(dòng)能力下降了18.8％，對(duì)

5、豬小腸上皮細(xì)胞的體外粘附和侵襲能力分別下調(diào)了40％和28％;小鼠排毒帶菌試驗(yàn)結(jié)果顯示攻毒24h后△hcp突變株的排毒量增加，表明突變株在小鼠體內(nèi)粘附能力下降;并且細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，△hcp突變株實(shí)驗(yàn)組的Vero細(xì)胞存活量是野生株實(shí)驗(yàn)組的7倍;但是，通過(guò)RealTime-PCR試驗(yàn)檢測(cè)分析△hcp突變株的Ⅰ型菌毛fimH)、F18ab菌毛(fedF)、鞭毛(fliC），AIDA(adhesininvolvedindiffuseadhe