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文檔簡介
1、為了探討熱應激誘發(fā)動物免疫抑制的可能機理,本研究以巴馬香豬為試驗材料,應用實時熒光定量PCR、ELISA、放射免疫和細胞培養(yǎng)等技術,系統(tǒng)分析了:(1)巴馬香豬TLR2、TLR4基因和蛋白的分子特征;(2)熱應激條件下體內和體外PBMC內參基因的表達穩(wěn)定性;(3)熱應激發(fā)生不同時段PBMC TLR2、TLR4 mRNA、血漿皮質醇和IL-2、IL-8表達水平;(4)原代培養(yǎng)的PBMC在熱打擊后不同時段TLR2、TLR4及其選擇性剪接體mR
2、NA和IL-12、IFN-γ表達水平的變化。研究結果如下:(1)巴馬香豬TLR2基因開放閱讀框長2358 bp,編碼785個氨基酸,該蛋白等電點為7.52,分子量為89.48 kD;與普通豬比對發(fā)現(xiàn)巴馬香豬TLR2基因有15個堿基發(fā)生突變;與小鼠、狗、雞、牛、羊和人的同源性分別為73.4%、82.4%、59.5%、85.3%、84.6%和82.4%;TLR2膜外區(qū)蛋白為背側多個α螺旋和內側多個β折疊平行交替排列構成一個彎曲狀螺旋結構;N
3、末端存在信號肽,且可能在21~22位氨基酸處存在裂解位點;胞外區(qū)有4個明顯的LRR,分別位于第76~99、360~385、413~432和457~476位氨基酸區(qū);膜外區(qū)含6個N連接的糖基化位點。
(2)巴馬香豬TLR4基因開放閱讀框長2526 bp,編碼841個氨基酸,該蛋白等電點為6.58,分子量為96.4 kD;與普通豬比對發(fā)現(xiàn)巴馬香豬TLR4基因有5個堿基發(fā)生突變;與小鼠、狗、雞、牛、羊和人的同源性分別為71.9%
4、、81.5%、54.2%、86.4%、85.5%和81.9%;TLR4膜外區(qū)蛋白為背側多個α螺旋和內側多個β折疊平行交替排列構成一個彎曲狀螺旋結構;N末端存在信號肽,且可能在23~24位氨基酸處存在裂解位點;胞外區(qū)有13個明顯的LRR,分別位于第53~74,77~100,101~124,149~173,174~192,201~225,372~393,398~429,446~469,470~494,495~518,519~541,543~
5、566位氨基酸區(qū);膜外區(qū)含8個N連接的糖基化位點。
(3)通過RT-PCR驗證了TLR4-ASV mRNA的存在。并對其可能編碼的蛋白生物信息學分析,結果發(fā)現(xiàn):可能的TLR4-ASV蛋白是一種截短的蛋白質,不存在信號肽結構,不屬于非經典分泌蛋白,比正常TLR4蛋白少了6個LRR,存在跨膜結構,胞外結構明顯縮短。
(4)在熱應激條件下,GeNorm和NormFinder分析得出的體內PBMC中6種常用的內參基因
6、的穩(wěn)定性由高到底依次為:ACTB/RPL>B2M>TBP>18s RNA>GAPDH和B2M+TBP>B2M>TBP>RPL>ACTB>18s RNA>GAPDH;體外培養(yǎng)的PBMC中5種常用的內參基因的穩(wěn)定性由高到底依次為:TBP/B2M>ACTB>RPL>GAPDH和TBP+ACTB>ACTB>TBP>RPL>B2M>GAPDH。
(5)在體內模型中,對照組巴馬香豬PBMC TLR2 mRNA隨應激時間延長,總體變化趨
7、勢不大,而應激組。PBMC TLR2 mRNA水平有先上升后下降的趨勢。相同時間點比較發(fā)現(xiàn),除第一天外,應激組TLR2 mRNA水平明顯升高(p<0.05)。而應激組TLR4-A11 mRNA水平在第1、7、14和21天均極顯著高于對照組(p<0.01)。對照組血漿皮質醇濃度總體變化不大,而應激組皮質醇濃度隨時間延長有上升的趨勢。在熱應激第7、14和21天應激組皮質醇濃度顯著高于對照組(P<0.05)。對照組血漿IL-2水平呈先上升后下
8、降的趨勢,總體上變化并不大。而應激組IL-2水平隨時間延長有上升趨勢。在熱應激的第1天、第7天應激組IL-2水平顯著低于對照組(P<0.05)。IL-8無論在應激組或對照組都有下降趨勢,但同一時間點兩者差異不顯著(P>0.05)。
(6)在體外模型中,對照組巴馬香豬PBMC TLR2 mRNA水平總體變化不大,而熱應激組PBMC TLR2 mRNA水平有先上升后下降的趨勢。在應激后恢復的第3小時,應激組TLR2 mRNA水
9、平顯著提高(p<0.05)且達到峰值。在第6、9小時應激組TLR2mRNA水平有下降趨勢。對照組TLR4-A11 mRNA水平變化不大,而熱應激組TLR4-A11mRNA水平有先上升后下降的趨勢。且在熱應激后恢復的第3和第6小時顯著提高(p<0.05),第6小時達到高峰。對照組TLR4-ASV mRNA水平總體趨勢變化不大,熱應激組TLR4-ASV mRNA水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在應激后恢復的第3小時應激組TLR4-ASV mRN
10、A水平極顯著提高(p<0.001),且在第6和第9小時均顯著高于對照組(p<0.05)。對照組血漿IFN-γ水平隨著應激時間的延長有降低的趨勢,而熱應激組IFN-γ水平有先抑制后恢復的趨勢。在熱應激后恢復的第1小時熱應激組IFN-γ水平顯著下降(p<0.05),之后逐漸恢復,到第3、6、9小時與對照組相比,差異均不顯著(p>0.05)。對照組血漿IL-12水平總體趨勢變化不大,熱應激組血漿IL-12水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在熱應激后
11、恢復的第1小時開始應激組血漿IL-12水平開始上升,到第6小時達到高峰且顯著高于對照組(p<0.05),之后開始下降,到第9小時與對照組差異不顯著(p>0.05)。
結論:(1)成功克隆了巴馬香豬PBMC TLR2、TLR4以及TLR4-ASV的mRNA。
(2)B2M/TBP和ACTB分別是巴馬香豬PBMC體內熱應激模型和體外熱應激模型中最適合的內參基因。
(3)熱應激上調了巴馬香豬PBMC
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