BnTR1在甘藍型油菜抗旱和耐鹽中的功能鑒定.pdf

1、油菜是我國乃至全世界主要的一種油料作物，是食用植物油的主要來源。油菜在其生命歷程中可能遭遇如干旱和高鹽等非生物脅迫，生長受到嚴重影響，導(dǎo)致產(chǎn)量大大減少。有研究發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶在植物逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，如一些U-box、SCF復(fù)合以及RING-finger等類型的E3泛素連接酶能參與植物干旱脅迫應(yīng)答途徑。BnTR1編碼一個具有RING-finger結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，因此本實驗對甘藍型油菜“揚油9號”(Y9，對照)及

2、以其為遺傳轉(zhuǎn)化受體獲得的過表達BnTR1基因甘藍型油菜分別進行了萌發(fā)期和苗期的干旱和鹽脅迫處理，初步鑒定了BnTR1在甘藍型油菜抗旱和耐鹽中的生物學(xué)功能，并探究其調(diào)控甘藍型油菜抗旱性和耐鹽性的分子機理。本研究的主要結(jié)果如下:
　　(1)通過PCR對BnTR1轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜進行陽性鑒定，并對得到的T0代陽性苗進行qPCR檢測，結(jié)果鑒定得到8棵T0代過表達BnTR1植株，過表達BnTR1的轉(zhuǎn)基因植株中BnTR1表達量是Y9中的2.8

3、-6.7倍;之后對T0代過表達植株的T1代幼苗進行PCR擴增，得到T1代過表達BnTR1甘藍型油菜植株。
　　(2)以Y9作為對照，考察過表達BnTR1甘藍型油菜T1代植株的農(nóng)藝性狀，包括株高、千粒重、單株產(chǎn)量等性狀，發(fā)現(xiàn)過表達BnTR1基因?qū)Ω仕{型油菜的農(nóng)藝性狀沒有明顯影響。
　　(3)對Y9和過表達BnTR1基因甘藍型油菜T1代幼苗進行連續(xù)14d斷水的自然干旱脅迫，并測定處理前后葉片中的相關(guān)生理指標，結(jié)果顯示:在干旱脅迫

4、下，T1代過表達BnTR1植株的長勢明顯比Y9好，且其葉片RWC和RWR較大，可溶性蛋白含量及SOD、POD酶活顯著增加，而MDA含量顯著下降;用PEG-6000對Y9和過表達BnTR1材料的T2代種子處理7d后，發(fā)現(xiàn)過表達BnTR1材料種子的發(fā)芽率、苗高和根長都高于Y9，通過DAB及NBT染色發(fā)現(xiàn)其葉片中的H2O2和O2-積累較少，且通過qPCR進行的抗氧化酶基因表達分析表明部分抗氧化酶基因的表達量明顯升高。
　　(4)用600

5、mMNaC1對Y9和過表達BnTR1基因甘藍型油菜T1代幼苗進行鹽脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達BnTR1植株的長勢明顯優(yōu)于Y9，且其葉片中的SOD、CAT及POD的酶活顯著提高，而MDA含量顯著降低;在150 mM NaC1處理條件下，過表達BnTR1材料的T2代種子發(fā)芽率、苗高和根長都比Y9高，通過DAB及NBT染色發(fā)現(xiàn)其葉片中的H2O2和O2-積累較少，且抗氧化酶基因的表達分析發(fā)現(xiàn)部分抗氧化酶基因的表達量明顯升高。
　　(5)通

6、過酶切連接的方法構(gòu)建得到用于亞細胞定位的植物表達載體pMDC83-BnTR1，并進行煙草葉片表皮細胞瞬時表達，通過熒光顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)BnTR1蛋白可能定位于細胞膜上和細胞質(zhì)中。
　　(6)通過酶切連接的方法構(gòu)建得到用于酵母雙雜交的誘餌蛋白載體pGBKT7-BnTR1，利用酵母雙雜交技術(shù)在甘藍型油菜葉片非生物逆境脅迫混合文庫中初步篩選得到5個BnTR1的潛在互作蛋白，包括CRT1b、CAT2和CIPK9等。
　　綜上所述，本